蒽酮比色法

用于测定葡萄糖的含量

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以与游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糖基及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。本法多用于测定糖原的含量，也可用于测定葡萄糖的含量。

测糖试验

一　实验目的　掌握蒽酮比色法测糖的原理和方法

二　实验原理　蒽酮可以与游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糖基及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620nm处有最大吸收。

三　实验器材及试剂

马铃薯干粉

可调试移液器或移液管

可见分光光度计（723型）

电子分析天平

水浴锅

电炉子

蒽酮试剂：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，当日配制使用。

标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸馏水中，定容到1000ml备用。

四、操作

1.制作标准曲线

取7支干燥洁净的试管，按表1顺序加入试剂，进行测定。

以吸光度值为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml ）为横坐标作图得标准曲线。

表1 蒽酮比色法定糖——标准曲线的制作

沸水浴中准确煮沸10min，取出用流水冷却，室温放10min,于620nm处比色

葡萄糖浓度（mg/ml）

2.样品含量的测定

样品液的制作：

精确称取马铃薯干粉0.1g置于锥形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不时摇动）—→取出，

3000rpm离心10min（或过滤）—→反复洗涤残渣2次—→合并滤液—→冷却至室温—→定容到50ml的锥形瓶中—→再从中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中

样品液的测定：

（1）取4支试管，按照表2加样（加蒽酮时需要冰水浴5min冷却）

表2 蒽酮比色法定糖——样品的测定

（2）加样冷却完成后置沸水中煮沸10min，取出流水冷却放置10min，620nm处比色测量各管OD值。

（3）以1号试管作为调零管，2、3、4号管的OD值取平均后从标准曲线上查出样品液相应的含糖量。

3．结果计算：

C×V

w = ————×100%

m，

式中w：糖的质量分数（%）

C：从标准曲线中查出的糖质量分数（mg/ml）

V：样品稀释后的体积（ml）

m：样品的质量（ml）

原理

植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化，在生理上和实践上都有重要的意义。这里介绍的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物，颜色的深浅与糖含量有关。方法简便，但没有志一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。

仪器药品

721型分光光度计　　分析天平

研钵　恒温水浴锅

烧杯　容量瓶

三角烧瓶　大试管

移液管　漏斗

乙醚　草酸钠

饱和醋酸铅

葡萄糖标准溶液：称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200μg的标准溶液。

蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84）稀释成1000ml而成。

操作步骤

1．可溶性糖的提取

称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70℃热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水30─40ml。将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度70─80℃约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.2─0.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。

2．显色及比色

吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。

3．绘制标准曲线

取标准葡萄糖溶液将其释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A026－糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。

4．计算样品中含糖百分数(% )

设V为植物样品稀释后的体积(ml)

C为提取液的含糖量(μg/ml)

W为植物组织鲜重(g)

则得计算式如下： %=C×V/（W×1000000）×100%

多糖含量

[a]多糖含有几百个或更多残基，但只有一个还原基团，因此它的还原能力极弱，对于他们的测定，应先将它们用酸水解成单糖组分。

蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。因此可用此方法测定多糖含量。

[b]试剂

2g/L蒽酮试剂：溶解2g蒽酮于1L浓硫酸（98%的浓硫酸）中，当日配制使用。

0.01g/L葡萄糖溶液（可加几滴甲苯作防腐剂）

0.1g/L糖元溶液

[c]实验器材

试管及试管架吸量管（1ml，5ml）恒温水浴箱（100℃）制冰机紫外分光光度计滴管白瓷板

制作标准曲线

准确称取0.1g葡萄糖（分析纯），溶解并用蒸馏水定容至100ml后，分别取出1ml,2ml,3ml,4ml,5ml分别加入到50的容量瓶中，并用蒸馏水定容到50ml，配成浓度分别为20ug/ml,40ug/ml,60ug/ml,80ug/ml,100ug/ml,各取1ml于试管中，再加入3ml的蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100℃恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球或者加一个塞子，自温度重新升至100℃起计时，准确保温10min后取出，用流动水冷却，然后，于室温中平衡片刻（约10min左右），在分光光度计上，波长620nm处，用0.5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白（此处的空白是指不加葡萄糖的蒽酮试剂，其他反应条件都一致），进行比色。

既得标准曲线。

如下表格

[d]样品测定

如上述条件一致，但要记得用除去蛋白质的样品溶液进行测定，否则会影响测定结果。

样品含糖量计算：

C×V2×D

样品含糖量（%）=----------------------×100%

W×V1×10

其中C----在标准曲线上查出的糖含量（ug）,

V2---提取液总体积（ml）

V1---测定时取用体积（ml）

D-----稀释倍数