蔗糖酶

糖苷酶

蔗糖酶又称“转化酶”。糖苷酶之一，蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。

简介

糖苷酶之一。催化蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。

自1860 年Bertholet 从啤酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae 中发现了蔗糖酶以来, 它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（β -D-呋喃果糖苷果糖水解酶，fructofuranoside fructohydrolase， invertase）（EC 3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解, 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖 , 也能催化棉子糖水解, 生成蜜二糖和果糖。

该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧, 在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶(external yeast invertase)，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% ~70(质量分数) 糖成分的糖蛋白；在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基（二聚体）结构，2种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多2种氨基酸——丝氨酸和蛋氨酸，它们的分子质量也不同，外酶约为270KD（或220KD, 与酵母的来源有关），内酶约为135KD。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，但由于内酶含量很少，极难提取。

作用

蔗糖在蔗糖酶的催化下．水解为D-葡萄糖和D-果糖两种还原糖。蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用．并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。

植物中蔗糖酶的分类

根据植物中蔗糖酶所处亚细胞位置，蔗糖酶可分为液胞型蔗糖酶、细胞质型蔗糖酶和细胞壁型蔗糖酶。前两者又统称为胞内蔗糖酶，细胞壁型蔗糖酶又被称为胞外蔗糖酶。不同的蔗糖酶进行反应所需的最适pH 值也有所不同，由此蔗糖酶又可分为酸性蔗糖酶和中性/碱性蔗糖酶。液胞型蔗糖酶和细胞壁型蔗糖酶在pH4 .5 至5 .0 时催化效率最高，因此也称为酸性蔗糖酶。细胞质型蔗糖酶水解蔗糖的最适pH 值为中性或略微偏碱性，因此称为中性/碱性蔗糖酶。而根据其溶解性，蔗糖酶又可分为可溶性蔗糖酶（包括液胞型蔗糖酶和细胞质型蔗糖酶）与非溶性蔗糖酶（细胞壁型蔗糖酶）。

提取方法

酵母提纯

酵母离心(8 000 r/min)15 min后收集菌体。将收集到的菌体用蒸馏水洗涤，离心，再洗涤，重复数次，直到菌体呈白色，倾出上清液，将不含杂质的干净的酵母保存待用。

粗酶液的制备

准确称取离心分离后的酵母10 g，加入60 mL 0．5 mmol/L的SDS溶液溶解，在pH值为5．5、50℃水浴中加热12 h后取出，4℃、10 000 r/min离心20 min．上清液即为粗制酶液。4℃保存。

葡萄糖标准曲线的制定

以葡萄糖含量为横坐标。以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

蛋白质标准曲线的制定

以蛋白质含量为横坐标。以吸光度为纵坐标。绘制标准曲线．

蔗糖酶活性的测定

稀释酶液0．5 mL．加入0．3 mL pH值为4．6、0．1 mol/L的NaAc—HAc缓冲液．0．2 mL 0．1 mol/L的蔗糖溶液．37℃准确反应15rain后．加0．125 mL l mol/L的NaOH溶液中止反应。用DNS法在540 nm波长下测定形成的还原糖量。在该条件下。蔗糖酶液1 min转化底物蔗糖生成1g葡萄糖定义为1个活力单位。

粗酶的乙醇初步分离

在所提粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达30%，4℃放置过夜，4℃、10 000 r/min离心15 min．取上清液．追加乙醇使其质量分数达50%，4℃放置1 h，4℃、11 000 r/min离心15 min．弃上清液．沉淀用双蒸水溶解．4℃保存。经SDS抽提法提取．质量分数50%的乙醇沉淀所得的酶液用透析法(pH值为7.0的0.05 mol/L%s—HCI缓冲液)充分透析。所得透析液4℃保存。

SDS抽提法提取啤酒酵母中蔗糖酶

工艺条件优化：在单因素试验的基础上。选取SDS摩尔浓度、pH值、提取温度、提取时间4个条件，考察其对酵母蔗糖酶抽提效果的影响．采用4因素3水平正交表L934。做正交试验。

蔗糖酶的纯化

采用O一琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱层析纯化粗酶液。将SDS抽提法提取出的蔗糖酶活性高的粗制酶液经质量分数50%的乙醇沉淀，溶解透析后，过Q-琼脂糖凝胶FF阴离子交换柱(用pH值为7．0、0．05 mol/L Tris-HCl缓冲液充分平衡)。用0～1 mol/L、60 min线性梯度的NaCI溶液(内含pH值为7．0、0．05 mol/L%s-HCI缓冲液)洗脱。体积流量为0．5 mL/min，每管收集mL。测定各管洗脱液的蔗糖酶活性与蛋白质含量，合并蔗糖酶活力高的若干管流出液。流出液经过透析脱盐,真空干燥后即为纯化的酵母蔗糖酶。

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