蛋白质顺序分析

蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序

蛋白质顺序分析是蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序。测定蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序，又称蛋白质的一级结构分析。一般需要以下的技术和步骤：蛋白质的纯化，测定分子量，分析辅基或配基，氨基酸定量组成分析，末端分析，拆开二硫键，肽的裂解、纯化及顺序测定，寻找接头肽以连接成完整的肽链，再经过二硫键定位，最后列出完整蛋白质的顺序。

基本介绍

蛋白质的纯化

待测定顺序的蛋白质样品，需要较高的纯度。须通过多种方法鉴定,如末端分析、电泳、等电聚焦、氨基酸定量组成分析等都证明是均一的蛋白质，杂质含量在5%以下，才适于做顺序分析。

测定分子量

一般用凝胶过滤法，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。从两种数据，还可知道样品蛋白质是否有亚基结构。

辅基和配基分析

简单蛋白质不含辅基和配基。但结合蛋白质含糖、核酸、脂质或其他有机化合物，这些物质会干扰顺序分析，需采用特殊方法除去。

氨基酸定量组成分析

用氨基酸自动分析仪能准确测定蛋白质样品中各种氨基酸的含量，特别是某些氨基酸，如甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸和赖氨酸等的含量对设计顺序测定方案很重要。

末端分析

多肽链的一端为NH2，称为N端，另一端为COOH，称为C端。N端测定用DNFB（2,4-二硝基氟苯），DNS-Cl (5-二甲氨基萘磺酰氯)，PITC(异硫氰酸苯酯)和DABITC(4-N，N-对二甲基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯) 等化学试剂测定。也可用氨肽酶法。C 端用肼解法或羧肽酶法测定（也可用还原法，用LiBH4将氨基酸变成氨基醇）。有的蛋白质的N末端被其他化学基团，如乙酰基,或环化谷氨酸所封闭，就不能用上述方法测定。通过末端分析也能了解蛋白质由几条肽链组成和样品的纯度。

拆开二硫键

肽链中的半胱氨酸残基，常以二硫键的方式与肽链中的其他部位半胱氨酸残基连接，测定顺序时须先拆开二硫键，使肽链呈松散的直链，便于降解和裂解。拆开方法是用巯基试剂还原羧甲基化，或用过甲酸氧化等。

肽的裂解和纯化

先将蛋白质裂解成较大的肽段，以减少纯化和顺序测定的工作量。在一般蛋白质分子中，甲硫氨酸、色氨酸和精氨酸等含量较少，可用专一性高的试剂或酶针对这类氨基酸的肽键裂解,如用溴化氰,氢溴酸和胰蛋白酶等，能得到预期的结果。肽的纯化，一般用离子交换层析,凝胶过滤,电泳和纸层析等方法。70年代以来采用高效液相层析仪，其分辨率高,速度快,是纯化肽的最好工具。

肽的顺序测定

①埃德曼（Edman）降解法。用化学试剂──异硫氰酸苯酯,能依次从N端逐个把氨基酸残基降解下来。每一步反应得到一个氨基酸衍生物。经多次重复的反应就得到更多的降解产物，分别鉴定后，即可列出肽链的氨基酸顺序。根据这个原理设计的自动顺序仪，一昼夜连续运转，可测出10多个顺序。但由于化学反应率的限制，不可能无限制地降解到底，因为即使在最好的条件下，每步反应率到98%，一般只能测到50步左右，这时留下的可供反应的N端愈来愈少，杂质愈来愈多,难以继续测定。所以通常需先把肽链裂解成肽段后再测其顺序。②酶法测顺序。用氨肽酶能从N端依次降解,用羧肽酶能从C端依次降解。酶解释放氨基酸是个动力学过程,需在不同时间取样定量测定，根据释放的过程列出顺序，由于酶解过程难以控制，此法得到的数据，一般仅为几个氨基酸顺序。

接头肽

在完成许多肽段的顺序测定后,需要寻找接头肽以把各肽段连接起来而完成蛋白质的全部顺序。其连接法。用一个字母表示一个氨基酸残基：

第1种切法　ABCDEFG HIKLMNOP QRSTVWXYZ

第2种切法　 FGHIK　OPQRS

完整的肽链　ABCDEFGHIKLMNOPQRSTVWXYZ

二硫键定位

用专一性低的蛋白水解酶，如胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等水解完整的蛋白质成为小的肽段，经分离纯化，找寻含二硫键的肽段。亚硝基铁氰化钠是二硫键的特殊显色剂。测定这些肽段的氨基酸组成和顺序，即可确定肽链内部二硫键的位置，得到完整的蛋白质的氨基酸顺序。

其他方法

上面介绍的经典的蛋白质顺序测定法，是非常繁琐而工作量浩大的工作。50年代初测定含51个氨基酸残基的胰岛素花了8年时间,现在用自动化仪器和先进检测工具,只需花一周时间。1978年发表的β-半乳糖苷酶，含1021个氨基酸残基，可以说是经典法测定的顶峰。目前新的快速方法是从核酸(DNA)顺序推测蛋白质顺序,已经广泛采用，因在短期内可测数千个核苷酸顺序,从DNA的三联密码能准确推测出蛋白质的氨基酸顺序。这一方法近年来已经有取代上述经典方法的趋势，但是尽管如此，某些环节还须蛋白质顺序测定的经典法配合。

研究历史

历史上第一个被确定氨基酸序列的肽（蛋白质）——胰岛素（insulin）。

1943－53年，Sanger确定了牛胰岛素的一级结构，1958年获得Nobel化学奖。

1958年，Moore 和 Stein在Sanger 和Edman测序法基础上设计出氨基酸全自动分析仪，获1972年Nobel化学奖。

历史上第一个被确定氨基酸序列的酶（1960年）——核酸酶（ribonuclease, 124 AA）。

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