蜂毒肽

化学品

蜂毒肽（Melittin）是蜂毒的主要成分和主要生物活性物质，约占蜂毒干重的40%~50%，是由26个氨基酸残基组成的多肽，分子式为C131H229N39O31，相对分子量为2846.46。蜂毒肽呈强碱性（pH=10），易溶于水，它在蜂毒中起主要的药理作用，是目前人类所知抗炎性最强的物质之一。它具有类似激素的作用，却不具有激素的不良反应。此外，亦具抑菌、抗辐射、抗病毒等作用。蜂毒肽还可以刺穿艾滋病毒的保护外层，毁灭艾滋病毒，但又不伤及周围正常细胞。近年来又有对其抗癌作用进行研究的报道。但是其临床应用却有很多局限，主要原因是现有技术难以将蜂毒中有致敏反应并与蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。

研究简史

人类社会利用蜂毒的历史悠久，同时人们对蜂毒和蜂毒肽的研究也在不断深入。自从1952年Neuman等人用电泳法分离获得蜂毒肽以来，关于蜂毒肽的研究拉开了帷幕，很多研究发现蜂毒肽对体内外多种肿瘤细胞都有杀伤作用。

1972年，Habermant报道1μmol/L的蜂毒肽就能阻止肿瘤细胞增殖但却不抑制正常细胞的生长与克隆率。

1983年，Vlasak等用mRNA-DNA逆转录的方法，利用质粒pBR322构建了蜂王毒腺的cDNA文库，用蜂王毒腺总mRNA制作探针从此文库中分离得到了蜂毒肽的cDNA，再进一步将其克隆到质粒pUC18上进行DNA序列分析，由DNA的序列分析结果推测出的蜂毒肽序列与实际测得的完全相同。

1996年，Arora通过对正常大鼠肝细胞与大鼠肝癌细胞抗缺氧损伤能力的实验对比，证实蜂毒肽激活磷脂酶A2（PLA2）能够解除肝癌细胞对缺氧的抵抗。DUnn等将来自于鼠抗人骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞表面特异蛋白的抗体SCFV基因同蜂毒肽基因相融合，构建了能杀肿瘤细胞的抗毒素基因，大肠杆菌中融合基因并表达，精制的抗毒素显示了体外杀死肿瘤细胞的效能。Kindas等从处女蜂王的毒腺中提取得到了总mRNA，发现蜂毒肽mRNA含大约400个碱基对和1个短的polyA尾。Haase实验表明蜂毒肽可以激活细胞脂酶，包括磷脂酶C（PLC）、磷脂酶D（PLD）、磷脂酶A2（PLA2）及甘油三酯酶等。

1991年，张青文开始提取了蜂王毒腺的RNA，用于棉铃虫卵中的转译，成功地合成了Promelittin，并对提取的mRNA成分进行了研究，结果发现总RNA在除去rRNA后就可得到高纯度的蜂毒肽mRNA。

1997年，李继周等通过mRNA-cDNA反转录的方法合成了蜂毒肽基因，用λgt11建立了蜂毒肽的cDNA文库，并用抗体探针筛选出能够表达蜂毒溶血肽的阳性克隆。Benachir等利用钙黄绿素作为荧光标记物，系统研究了蜂毒肽诱导的膜渗漏。认为蜂毒肽与囊泡的结合会非常迅速，而且在蜂毒肽作用下，有的囊泡的内容物全部释放，而有的则保持完整。内容物释放的比例与蜂毒肽/脂质的摩尔比率有关。更为特别的是蜂毒肽可以区别出完整的和已经有物质渗出的囊泡，而且表明卵磷脂双分子层表面负电荷的存在对蜂毒肽的裂解能力有抑制作用，并且与负电荷的密度成一定比例。

1999年，Kubo等通过5种细胞毒的测定方法对蜂毒肽与嗜酸性粒细胞的主要碱性蛋白进行比较，结果证实蜂毒肽能插入K562细胞的胞膜中进而形成孔道，引起Ca2+内流，使胞内Ca2+浓度升高，细胞裂解。1小时内，蜂毒肽对实验的白血病细胞均具杀伤效果。Shamsher等研究发现蜂毒肽可激活磷酸脂酶D进而裂解人单核白血病细胞（U937）。

2000年，王关林等从蜜蜂毒腺中提取总RNA，通过RT-PCR方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，再进一步通过定点诱变在蜂毒肽序列前引入了经胺裂解位点，构建了与β-半乳糖苷酶部分序列相融合的蜂毒肽诱变蛋白表达载体，序列分析结果表明，他们成功地引入了目的密码子，且与β-半乳糖苷酶部分序列构成正确的读码框，并在大肠杆菌中表达了诱变蛋白。

2001年，黄雪强等通过人白血病细胞观察蜂毒肽促凋亡的作用，结果发现对白血病细胞5mg/mL蜂毒肽作用4h与4μg/mL蜂毒肽作用24h都可见典型凋亡特征，进一步实验发现其诱导细胞凋亡同bcl-2基因表达显著下降相关。王秋波等通过人工合成含特异性酶切位点的AB两条寡核苦酸片段，在Klenow酶作用下形成目的基因，用限制型内切酶HindⅢ，XmnⅠ同时酶切目的基因和表达载体Pmal-p2质粒，在T4连接酶的作用下构建两者的重组体，通过α-互补筛选出附性克隆，并通过特异性酶切和测序分析进行鉴定，获得重组蜂毒肽的原核表达克隆。

2003年，刘岭等通过MTT法对SMMC-7721、BEL-7402和Hep-3B三种肝癌细胞系进行研究，考察蜂毒肽抑制肿瘤的量效关系，结果显示：在8～64μg/mL剂量时，蜂毒肽的抑瘤率直线上升，在体外表现显著的抗瘤效果。据此推测，可能与在高浓度中蜂毒肽的自聚集相关，高浓度下多呈四聚体的状态，与单体相比更能与细胞膜有效地结合，进而形成离子通道，改变胞膜通透性，裂解胞膜，表现出极强的体外杀伤肿瘤的效果。

2004年，李柏、张晨等应用基因工程研究证明，蜂毒素具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。经携蜂毒素基因重组腺病毒转染后，倒置相差显微镜下观察到部分肝癌细胞出现凋亡形态学变化，体积变小、变圆，染色质边集等现象。携蜂毒素基因重组腺病毒可有效诱导肝癌细胞凋亡，凋亡率在20%左右，高于不含基因重组腺病毒和未转染重组腺病毒对照组，提示诱导肿瘤细胞凋亡亦是蜂毒素基因治疗发挥作用的机制之一。

2005年，赵亚华等通过实验有目的地改造了蜂毒素的氨基酸的一级结构序列以及所要表达的蜂毒素基因。尽量使蜂毒素在与细菌细脑膜相互作用时，主要采取地毯模式侵膜而引起杀菌，同时，由于带电荷数与分子构象的改变，大大降低了它与血细胞膜两亲性作用的几率，从而达到抑制溶血性的目的。改造后的蜂毒素的溶血性与标准样品的溶血活性相比，有较大幅度降低，大约降低了14.3倍。

2009年8月11日英国《每日邮报》报道，美国华盛顿大学的科学家公布一项研究成果——他们借助纳米技术，开发出一种在显微镜下才能看到的“纳米蜜蜂”。“小蜜蜂”能钻进癌细胞，释放蜂毒肽，将癌细胞一个个消灭掉。“小蜜蜂”内部还有专门的定位物质，能够指引它一路前行，直达患处。在实验中，“纳米蜜蜂”已经令患有乳腺癌的小白鼠体内的癌细胞减少了45%，而患有皮肤癌的小白鼠体内的癌细胞则锐减了75%之多。

理化性质

蜂毒肽是由26个氨基酸残基组成的多肽，其一级结构的氨基酸残基顺序为Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH2

在通常情况下，C-末端有4个氨基酸残基携带正电荷，N-末端有2个氨基酸残基携带正电荷，整个分子带6个正电荷。蜂毒肽的N-末端起前20个氨基酸残基主要是疏水的，C-末端的6个氨基酸残基主要是亲水的。

分子的3个赖氨酸和2个精氨酸残基使其成为强碱性肽，在中性水溶液中，蜂毒肽作为单体是以随机的卷曲结构存在的，而随着pH值以及离子强度的增高，蜂毒肽自我交联，形成螺旋的四聚体结构，有研究发现在不同的溶液中蜂毒肽的螺旋结构区域及螺旋间的角度是不同的。螺旋结构中前21个氨基酸是极性的，位于螺旋的表面，而非极性氨基酸在螺旋的另一面。其两亲性（am-phiphilie）是膜结合肽和膜蛋白跨膜螺旋的特征。所以这个特性决定蜂毒肽既可以溶于水中，又可以与膜自然结合，进而溶解细胞。

明蜂毒肽对超氧阴离子和羟自由基均有很好的清除作用。蜂毒肽对超氧阴离子具有一定的清除作用，呈现明显的量效关系。蜂毒肽对于·OH的清除作用效果明显。

制备方法

目前获取蜂毒肽的方法有3种，化学合成、从粗蜂毒中分离纯化和生物工程法。利用化学合成的方法可以获得具有生物活性的蜂毒肽纯品，但其成本太高，并不适合蜂毒肽的生产，实际应用较少。目前，获取蜂毒肽纯品的主要途径是从粗蜂毒中分离纯化。分离纯化方法以色谱理论为基础，随着色谱技术的发展以及与其他提取工艺的结合，操作成本逐渐降低，产量和纯度有所提高。利用生物工程技术可以诱导蜂毒肽基因在工程菌中表达，然后收集纯化表达蛋白，从而得到蜂毒肽纯品。由于蜂毒肽有破坏细胞膜以及致死细胞毒性，其在工程菌中的直接表达无法实现。面对这个问题，科学家们找到了在工程菌中表达蜂毒肽融合蛋白的方法，并在融合蛋白的选择及后期分离纯化上进行了大量研究，取得较大进展。

应用领域

蜂毒肽具有多种生物学、药理学和毒理学作用，包括对细胞膜的强表面活性作用、溶血、抗菌以及潜在的抗肿瘤作用。蜂毒肽可以穿过磷脂双分子层形成孔洞，利用这种生物活性可以研究生物膜与蛋白质之间的相互作用。在发现蜂毒素对磷脂酶A2（PLA2）活性的增强作用后，蜂毒素也被用作磷脂酶A2（PLA2）的活化剂。蜂毒肽还是一种独特的致痛物质，它影响着躯体感觉系统的神经元可塑性。

蜂毒肽是迄今为止人类所知的抗炎活性最强的物质之一，其抗炎活性是氢化可的松的100倍，可以抑制20多种革兰氏阴性和阳性细菌的生长繁殖，尤其是蜂毒肽可以抗对青霉素具有耐药性的金黄色葡萄球菌。蜂毒肽还能增强磺胺类和青霉素类药物的抗菌效力，对多种真菌、病毒也具有毒性。它具有类激素样的作用，但无激素的不良反应。蜂毒肽的镇痛作用也十分显著，其对前列腺素合成酶的抑制作用是吲哚镁辛的70倍，镇痛强度为吗啡的40%，镇痛持续时间较长。实验研究证明，全蜂毒、蜂毒肽、神经毒多肽、MCD均能刺激垂体肾上腺系统使皮质激素释放增加而产生抗炎作用。蜂毒肽还能抑制白细胞转移，从而抑制了局部的炎症反应。可直接抑制炎症、肿胀；刺激垂体一肾上腺系统，促进皮质激素的释放，抗炎调整免疫功能，还可直接升高血浆皮质醇；抑制白细胞移行，限制炎症的局部反应。可用于治疗胶原组织疾病、免疫系统疾病。

蜂毒对神经系统具有抑制作用：①抑制中枢神经系统，表现为胆碱对神经的阻滞，造成半球皮层和皮质下（特别是下丘脑）的广泛抑制；②抑制植物神经系统交感神经节的兴奋传导，使胃肠平滑肌活动和兴奋性增强；抑制周围神经冲动的传导，阻碍或延迟其传导速度。

用蜂毒肽代替蜂毒全毒不仅对辐射有预防作用，而且还有治疗作用。高纯度的蜂毒肽可以明显提高抗辐射效应，而且和全蜂毒比较差别非常明显。蜂毒肽对肿瘤细胞的毒性作用也引起了人们的注意。蜂毒肽具有膜活性，直接对细胞的磷脂膜起溶解作用，抑制细胞发育，对肿瘤细胞有强烈的细胞毒素作用。蜂毒肽分子量小，免疫原性低，不易产生过敏反应；因其是破坏细胞膜而导致细胞的死亡，因此它不用进入细胞，在细胞外即可显示出其破坏肿瘤细胞毒性。澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRo）DERiven博士领导的分子生物学研究小组制造的以蜂毒肽为“弹头”的抗毒素也可对前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌产生疗效。蜂毒素可抑制肝癌细胞的生长、增殖，并且减少增殖细胞中和抗原附性细胞的表达，影响细胞周期的比率。

抗凝、纤溶作用：通过抑制凝血活酶和凝血酶原激活物生成，以及抑制血小板的聚集，可以消除血栓形成前的状态，临床可用于动脉粥样硬化和血栓形成的防治。蜂毒肽通过破坏红细胞膜的通透性，具有直接溶血作用。

降压、抗心律失常，改善脑血流及心肌功能作用：蜂毒肽可破坏肥大细胞和亚细胞结构而释放组胺入血液，降低外周阻力而降压，同时其释放的活性化合物作用于脑血管，通过扩张脑血管增加脑血流量，因此特别适用于高血压病患者导致的脑循环障碍；并且还增加冠脉血流速，改善心肌供血，提高心脏功能，具有强刺激垂体一肾上腺系统的作用，使血浆皮质醇与尿17-酮固醇含量增加，表现为较强的抗心律失常的作用；并且还有降低胆固醇作用。

2013年3月，美国科学家发现可以利用在蜂刺毒素中发现的化学物质毁灭艾滋病毒，防止艾滋病传播，但又不伤及周围正常细胞。蜂刺中的化学物质蜂毒肽可以刺穿艾滋病毒的保护外层，毁灭艾滋病毒。科学家们把这种毒素注入纳米粒中，上面配有特制的“缓冲器”，使之能够弹离正常细胞，从而避免伤及正常细胞。当较小的艾滋病毒与它们接触时，会从缓冲器之间滑过，遭到毒素攻击。此前，大多数药物只能减缓艾滋病毒的生长，而最新研究出的这种蜂毒能够攻击并杀死病毒，第一时间防止感染。医生们还认为，可以进一步开发纳米粒子，尝试杀死肿瘤细胞。

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