酶切技术

真核生物的遗传物质

DNA是真核生物的遗传物质，由脱氧核苷酸组成。它是双链互补的螺旋结构，定向酶切技术就是用限制性内切酶去切割DNA片段，由于酶具有专一性，一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，所以可以用特定的这种酶去切割相应的DNA片段，进而达到定向切割的目的。

双酶切

同步双酶切

同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。

分步酶切

如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。

使用特殊酶进行双酶切

使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。

限制性内切酶

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成:一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端,如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'

3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。

酶切实验

实验目的：

1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。

2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。

3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。

基本原理

限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。

主要试剂

重组质粒DNA插入片段300bp

本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：

5′----G↓AATTC----3′

3′----CTTAA↑G----5′

磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。

操作步骤

1.反应体系的建立：

⑴在一无菌1.5mlEppendorf管中加入：?

无菌双蒸水7μl?

10×酶切缓冲液2μl?

质粒DNA(100ng/μl)10μl?

EcoRⅠ(5U/μl)1μl?

总体积为20μl

⑵轻轻混匀，12000rpm离心5sec。

2.37℃水浴1h。

3.将Eppendorf管置65℃水浴中10min，通过加热使酶失活以终止反应。

4.12000rpm离心5sec，将管盖及管壁上的水离下。

酶切技术

5.取10μl消化产物，与2μl6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100V30～60min。

6结果观察。

操作注意事项：

1.吸样量一定要准确

2.为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶

3.要求在冰上操作，并充分混匀，

4.开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

5.样品在37℃与65℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败

。

限制性内切酶酶解中常见的问题和原因

1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。

2．DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确；②DNA不纯或反应条件不佳；③酶切位点被修饰；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。

3．DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力；②存在第二种限制性内切酶污染；③样品DNA中含有其它DNA。

技术问题

1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。

纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，优选柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。优选TAKARA的纯化柱试剂盒。

酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50μl反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

摩尔比的计算，回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10　，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（Xpmoles×长度bp×650）/1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。

连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20μl的连接反应体系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350U/μl，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作。时间3个小时足已。

3、转化：

a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。

b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。

c、加入890μlAMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。

取100μl铺板。也可离心后余100μl。

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