重叠延伸PCR

将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术

重叠延伸PCR技术 (genesplicingbyoverlapextension PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。

技术原理

重叠延伸 PCR 的原理并不复杂，如果有 2 个基因或者一个基因和一个终止子，要将它们连接到一起，最先想到的是借助于限制酶切和 DNA 连接酶的方法，但有时并不一定能找到合适的酶切位点，或者找到了，但该酶又非常昂贵。且可能只用一次，在这种研究背景下，重叠延伸 PCR 技术就应运而生了。

比如有 2 个基因，一个命名为M。一个命名为 N，基因 M 和 N 序列如下所示：

M：5’一ATGCATGCTAGCTAGAACG—CTACGCTGACTACCCCCTGATC一3’

N：序列为5’一ATGCTAGTAGCTAGCCCCC—CCCAGGGGATAATTTTTTAAAACG一3’

要将它们连接到一起，首先必须要设计引物，假设引物的序列为：

M1：5'一ATGCATGCTAGCTAGAACGCT一3’

M2：3’-TGCGACTGATGGGGG-ACTAGTACGATCATCGATCGGGGGG-5'

N1：5’一ACGCTGACTACCCCCTGATCATGCTA—GTAGCTAGCCCCCC一3’

N2：5’一CGTTTAAAAAATTATCCCCT一3’

该过程的目的是将基因 M、N 通过 PCR 的方法连接起来，观察上面的引物 M2 和 N1，会发现它们要比另外2 条引物长很多，这是因为在设计的时候将 M2 的 3’端加入了 20 个 N 基因 5’ 端的序列，在 N1 的 5’ 端加入了 20个 M 基因 3’ 端的序列，然后再进行如下相关步骤：

①以M1、M2扩增M基因，N1、N2扩增N基因。

②回收M、N基因。

③以M、N为共同的模板，M1和N2为引物，扩增M+N，这样就将M+N拼接起来了。

对引物的分析如下：这里关键的2个引物是M2和N1。可以看出，M2的5’端前20个碱基与N序列5’端的前20个碱基互补，而M2的后20个碱基与M序列的3’端的前20个碱基互补。N1的5'端前20个碱基与M序列的3’端前20个碱基相同，即与M基因的另外一条链互补，N1的后20个碱基与N序列5’端的前20个碱基相同，即与N基因的另外一条链互补。M1和M序列的5'端前21个碱基相同。N2和N序列的3’端前21个碱基互补。

技术关键

引物设计

重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。相连引物间的重叠区域以15-20个碱基为宜，重叠区域中应尽量避免富含 AT(ATTTA，AATAA、AATTAA等) 的序列，因为在片段合成过程中，接头区富含AT的区域极易发生错配。

Taq酶选择

为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延伸 PCR 反应应避免使用普通 Taq酶，因为 Taq酶会在 PCR 产物末端加 A，从而可能会使产物移码突变。一般采用高保真 DNA 聚合酶。

热循环条件

对于重叠延伸 PCR 反应，循环不宜过多，变性的温度也不宜过高，时间不宜过长。高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。考虑到DNA 聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环数控制在 20-25 个为宜。循环次数过多，碱基错配的几率增大；循环次数太少，则得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。反应的退火温度也要根据引物而定，在保证产物扩增效率的前提下，应尽量提高退火温度以提高产物的特异性，为下一轮PCR反应提供高质量的模板，从而降低反应的错配率。

技术应用

利用重叠延伸PCR技术扩增长片段DNA

采用一段已知的500—600 bp碱基的DNA片段为PCR模板，根据所要合成的DNA序列可以设计一系列的PCR嵌合引物对(即碱基互补配对)，长度为50—60 bp，且从5’到3’方向顺序重叠，重叠碱基数目为25—30 bp，通过多重PCR全部引物叠加所得到的DNA正是自己所要合成的长片段DNA。

用重叠延伸PCR技术构建融合基因

以融合A和B两基因为例，A、B两基因可以相同也可以不同，先分别用al、c1和a2、c2两对引物扩增出A基因和B基因，然后再用al和c2将两基因连接起来，得到A、B的融合基因。也可以设计多对引物，融合多个基因。重叠延伸PCR可将任意的两个目的基因拼接连接，中间无任何目的基因以外的其他DNA序列，这样就可避免因加入连接序列可能出现的表达蛋白质的功能异常。

利用重叠延伸PCR技术进行基因定点诱变

基因突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一，可以有目的地改变DNA序列中的碱基，从而阐明基因表达的调控机理，研究蛋白质结构与功能间的关系，改造天然蛋白质，使之更符合应用需求。重叠延伸PCR技术可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物(如引物b和引物c)，然后分别与5’引物和3’引物(引物a和引物d)作PCR，这样得到的两个PCR产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到诱变的PCR产物。任何基因，只要两端及需要变异的部位的序列已知，就可用PCR诱变去改造基因的序列。方法简便易行，结果准确、高效，因此已成为最常用的定位诱变方法。

技术展望

1.同常规PCR相比，重叠延伸PCR技术无疑具有更广阔的应用前景。经过十几年不断的实践与总结，重叠延伸PCR方法的体系已日趋成熟，成为分子生物学研究中的常用方法。重叠延伸PCR已在许多研究领域发挥重要作用。

2.但是，作为一种没有标准化反应条件的技术体系，重叠延伸PCR技术在应用过程中还存在很多问题需要解决，例如最合适的引物长度、最佳连续延伸的循环数等。这些问题还需要进行系统的研究，才能为该技术的应用提供更有力的理论支持。

全国各地天气预报查询

上海市

云南省

云南省

云南省