铁蛋白

储铁蛋白

铁蛋白是一种广泛存在的储铁蛋白，具有纳米尺寸的水合氧化铁内核和笼形结构的蛋白质外壳。铁蛋白是含20%铁的蛋白质。通常，存在于几乎所有身体组织尤其是肝细胞和网状内皮细胞内，作为铁储备。微量的血清铁蛋白反映了正常的铁储备。检测血清铁蛋白是缺铁性贫血诊断的重要依据。

结构

铁蛋白的分子结构是由一层蛋白壳围绕着铁和磷酸盐分子组成的铁核，外径12～13nm，分子量500kDa。从不同来源（如人、马、牛蛙和细菌等）的铁蛋白结构特征来看，所有的铁蛋白虽然在一级结构上变化很大（氨基酸序列相似性有时才达到14%），但本质上都有相同的体系结构。蛋白壳均为由24个亚基以高度对称性方式组成的内空心结构，空心直径约为8nm，其中的氢氧化铁核中可积累多达4000个铁原子且不影响蛋白表面和与其它分子的相互作用；蛋白亚基中包括亚铁氧化的接触反应位点和与溶剂进行交换的亲水小孔。

特性

铁蛋白具有耐稀酸（pH值2.0）、耐稀碱（pH值12.0）、耐较高温度（70～75℃水温下不变性）等特殊性质。在很多研究中，就是利用铁蛋白的这些特性，从动物组织中提纯出该蛋白。

分布

蛋白质壳具有亲水性，故铁蛋白可溶于水并可溶于胞浆或血浆中，在细胞内、外液中均较稳定。铁蛋白主要是存在于细胞质中，但是在脊椎动物的线粒体和细胞核也有发现，并且在昆虫中是一种分泌蛋白。铁蛋白是体内铁的主要储存形式，其在脾脏、肝脏、骨髓中含量最高，在其它组织血清、血细胞等中也有发现。

存在方式

动植物体内广泛存在的一类贮存铁的蛋白。在哺乳类动物的肝和脾中含量最多。其外径约12~14nm，空囊腔径长约6nm，外壳（即脱铁铁蛋白）由24个亚基组成，每个亚基约含163个氨基酸残基，每个分子最多可结合4500个铁原子。分子量约为450kd。结合铁的铁蛋白是“溶”于水的，血浆铁蛋白的浓度与体内储存的铁成正比。

近几年来发现肝癌还含有一种酸性的异铁蛋白，称为癌胚异铁蛋白，可能有助于早期诊断。肝癌患者治疗有效者血清铁蛋白下降，而恶化和再发者升高，持续增高则予后不良，故血清铁蛋白测定可作为疗效监测手段之一，特别是对AFP阴性的患者尤有意义。

铁蛋白的性质

铁蛋白是一种含铁的蛋白质，广泛存在于各种哺乳动物的脏器如肝、脾、肾和骨髓内，尤以脾脏和肝脏为多。马脾脏含有最丰富的铁蛋白，故一般均由马脾脏内提取，并已结晶成功。它的特点在于含有约23%的铁，以氢氧磷酸高铁（分子量约为120，000）形式存在，有四个Fe(OH)2颗粒，铁在内部的分布是均匀的，使铁蛋自呈棕色。由于铁原子具有很强的电子散射能力，故在电子显微镜下明显地呈深暗色的胶粒结构，标记到抗体上以后仍可保持此特征。

提取及纯化

铁蛋白以肝、脾含量较高，其中马脾脏含量最高，标记用的铁蛋白主要是从马脾脏中提取。马脾脏来源不便，可用市售铁蛋白相对分子质量45000。棕红色结晶。商品为4次结晶品，悬浮于饱和硫酸铵溶液中。一种结合铁离子辅基的蛋白质，它以脱铁蛋白为外壳，环绕着4个分开的羟化铁-磷酸盐，形成电子致密的结合型蛋白质。在制备的过程中，加入N，N-1，3-丙二胺偶合铁蛋白，可成为正离子化铁蛋白。密封、4℃保存。

纯化方法：①取1mL商品铁蛋白溶液，用1000mL蒸馏水或1%的氯化钠溶液透析3次，去除重结晶过程中残留在铁蛋白中的硫酸镉。

②200rpm离心10min，去除大的聚合物。

③3000rpm离心1~2h，使其形成铁蛋白小球，弃上清。

④用结合反应所用的缓冲液悬浮沉淀。

⑤马脾铁蛋白约含15%的低聚物，将铁蛋白溶液过4B柱，收集流出液，取后2/3峰再过一次4B柱，可获得98%的单体铁蛋白。

⑥用50%的饱和硫酸铵使铁蛋白沉淀。然后将沉淀溶于少量双蒸水中，通过透析去除硫酸铵。

铁蛋白的鉴定

1、电镜鉴定

将铁蛋白水溶液滴在有Formvar膜的铜网上用3%磷钨酸染色3min自然干燥后电镜下观察可见含4个电子致密区球型蛋白分子，外被蛋白外壳直径12nm左右，内核7.5nm。

2、抗体和铁蛋白的结合

戊二醛作为偶联剂效果较好，对抗体活性影响小。可分为一步法和二步法。

戊二醛一步法：在0.9mL的0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.0）中溶解15mg铁蛋白和3mg抗体，加入0.1mL戊二醛，在37℃中放置24h，加入0.01mol/L赖氨酸中止反应，反应物加入0.02%NaN3防腐。

戊二醛二步法：在每毫升0.1mol/L磷酸缓冲液（pH值7.0）中溶解50~80mg铁蛋白，加入戊二醛使其终浓度0.05%~0.15%，在37℃中放置2h后，过G-25柱，去除戊二醛，收集洗脱峰，按抗体，铁蛋白1:5的比例，在37℃反应12h，加入0.01mol/L赖氨酸中止反应，反应物加入0.02%NaN3。

3、铁蛋白标记抗体的纯化

铁蛋白标记抗体后的混合液中含一些未标记的抗体蛋白等，应尽量去除。纯化方法：将标记的抗体复合物，在4℃的条件下加入1:3体积的饱和硫酸铵饱和度为25%，4000rpm离心15min，去上清将棕黄色标记的铁蛋白沉淀溶于少量0.1mol/L磷酸缓冲（pH值为7.2），过G-25柱除盐。

4、铁蛋白免疫电镜标记流程

(1)电镜包埋后标记样品取材、固定、包埋和超薄切片同包埋后免疫电镜操作流程。铁蛋白标记的抗体分子量较大，较适合于细胞表面抗原的定位研究。

(2)电镜包埋前铁蛋白标记细胞内抗原标记需对组织进行适当处理，以增强其通透性。多用包埋前间接染色法。孵育均在湿盒内进行。

操作程序如下：①将组织标本制成10~15m厚片。

②切片漂洗后，1%BSA孵育，室温30min。

③特异性抗体（第一抗体）中室温60min或4℃孵育过夜。

④PB充分漂洗3次，每次5min。

⑤铁蛋白标记的第二抗体孵育，室温30min。

⑥漂洗同上，再经戊二醛固定1h。漂洗后，1%锇酸后固定2h。其他步骤同常规电镜。

临床意义