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银染

检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法

银染是一种检测聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其原理是银离子在碱性 pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上显色。银染的方法种类很多，有文献报道的就有 100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别地清楚。由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于 1ng 的蛋白质点，故广泛地用在 2D 凝胶分析上，及极低蛋白含量测定的垂直凝胶中。

应用
主要是用于垂直凝胶电泳中低丰度蛋白的检测，如内源性GST-Pulldown、Co-IP等实验中相互作用蛋白的研究 。
实验操作流程
实验目的
检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
实验原理
在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，以使银颗粒沉积在蛋白带上。染色的程度与蛋白中的一些特殊的基团有关，不含或者很少含半胱氨酸残基的蛋白质有时候呈负染。银染的详细机制还不是非常清楚。
试剂：乙醇、冰醋酸（纯乙酸）、乙酸钠、硫代硫酸钠、硝酸银、碳酸钠、甘氨酸或 EDTA. Na2.2H2O、甲醛
实验操作程序
固定：30min或者更长时间 100ml 乙醇 40% 乙醇
25ml冰醋酸 10% 冰醋酸
加水到250ml
致敏：30min 75ml乙醇 30%乙醇
17g乙酸钠 28.2g三水乙酸钠
0.5g硫代硫酸钠（大苏打）
加水到终体积250ml
水洗：3 x 10min
银染：20min 0.625g AgNO3
100ul 37%甲醛（在使用前加入）
加水到终体积250ml
水洗：2 x 1 min (注意把握时间，水洗时间长显色速度慢，点的颜色偏黄色)
显色：视情况而定 6.25 g Na2CO3
50ul 37%甲醛（在使用前加入）
加水到终体积250ml
终止：10min 3.65g EDTA. Na2.2H2O或者1g甘氨酸
加水到终体积250ml
保存：1%冰醋酸，4 ℃
注意事项
1．固定时间较长，则加一步水洗30min，以免胶太脆而破碎。
2．甲醛在使用前加入。
3．最好多配制一份显色液，第一次显色到溶液变混浊时换一份显色液，显色到点清晰。
4．显色过程很快，要注意把握时间，避免染色过度。
5．银染液和显色液需要预冷。
6．所用器皿要很洁净，不用手直接接触，以免杂蛋白污染！
7．清洗用水尽量用高纯度去离子水，蒸馏水更佳，可以减少背景着色。
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