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黄曲霉毒素M1

有机化合物

黄曲霉毒素M1（AFM1），是一种有机化合物，化学式为C17H12O7，主要用于新陈代谢和致癌性的研究。

理化性质
密度：1.66g/cm3
熔点：299℃
沸点：644.3℃
闪点：11℃
折射率：1.718
外观：无色结晶性粉末，呈绿蓝色荧光
溶解性：溶于甲醇、乙醇和氯仿
分子结构
摩尔折射率：77.57
摩尔体积（cm3/mol）：196.7
等张比容（90.2K）：589.9
表面张力（dyne/cm）：80.8
极化率（10-24cm3）：30.75
计算化学
疏水参数计算参考值（XlogP）：0.5
氢键供体数量：1
氢键受体数量：7
可旋转化学键数量：1
互变异构体数量：10
拓扑分子极性表面积：91.3
重原子数量：24
表面电荷：0
复杂度：695
同位素原子数量：0
确定原子立构中心数量：2
不确定原子立构中心数量：0
确定化学键立构中心数量：0
不确定化学键立构中心数量：0
共价键单元数量：1
用途
主要用于新陈代谢和致癌性的研究。
检测方法
薄层色谱法
原理
样品经提取、浓缩、薄层分离后，AFM1在波长365nm的紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层板上显示荧光的最低检出量与标准溶液的荧光强度相比较来测定含量。
分析步骤
（1）AFM1标准溶液的配制
用三氯甲烷配制10μg/mL的AFM1标准溶液，用紫外分光光度计在357nm波长AFM1标准溶液的准确浓度（AFM1的摩尔消光系数为19950），避光4℃保存备用。
（2）样品提取
液体样品直接加入甲醇振荡过滤得提取液，固体样品粉碎过筛或研磨混匀后，用一定比例的甲醇水溶液振荡过滤得提取液。提取液可以先用石油醚和氯化钠溶液分配净化，再用三氯甲烷转相提取，氯化钠溶液水洗 ，无水硫酸钠脱水后，收集三氯甲烷层于65℃水浴通风挥干，最后用三氯甲烷将蒸发皿中残留物转移至浓缩管中，减压吹气法将此液浓缩至一定体积后备用。
（3）点样层析、展开、测定
各取10μL样品用浓缩液和标准液分别点于己在105℃活化2h的硅胶G薄层板上，置于加入一定量的展开剂的展析缸中展开，横展和纵展相结合，挥干后在紫外灯下观察并测量Rf值（一般AFM1的Rf值为0.34），并与标准溶液的最低检出量（0.0004μg）的荧光强度相比较，同时用硫酸溶液（1:3）显色剂喷荧光点，进行确证试验，最后按样品称 量值、浓缩体积、总稀释倍数、标准溶液最低检出量进行计算。
高效液相色谱法
原理
用C18柱抽提纯化样品中的AFM1，乙醚对C18柱洗涤，再用CH2Cl2-乙醇洗脱AFM1，然后加入三氟乙酸（TFA）对AFM1进行衍生化处理，利用液相色谱荧光检测器检测，并与标准AFM1-TFA的衍生物比较，进行定性、定量分析。
分析步骤
（1）AFM1标准溶液的配制
先用乙腈配制2000μg/mL的AFM1标准溶液，再用苯-乙腈（9:1）溶液配制成0.5μg/mL的AFM1标准浓度工作液，可用紫外分光光度计校正浓度（AFM1在乙腈中的摩尔消光系数为19850）。
（2）色谱条件
色谱柱：含球形的5μm颗粒大小的C18键合硅胶柱，柱长 25cm，内径0.4mm（如Spherisorb 5 ODS2）
检测器：具有365nm激发波长，＞400nm的发射波长，对lng AFM1-TFA衍生物的灵敏度为50～100%满刻度响应的荧光检测器（如Spectroflow 980）
流动相：水：异丙醇：乙腈（80:12:8）
流速：1.0mL/min
进样量：50～100μL
（3）样品提取、纯化
用C18 Sep-Pak试样提取柱或0.8×4.0cm的硅胶60净化柱净化乳液样品，乳液样品需充分混匀使不均质的乳脂分布均匀，加入同体积的热水（约80℃）充分稀释乳液。净化柱相继用乙醚；水-乙腈清洗，上样后用CH2Cl2-乙醇进行AFM1的洗脱上样和洗脱时流速不易过快，否则会得到偏低的回收率，然后将含AFM1的洗脱液真空低温（＜35℃）浓缩或氮气流下室温吹干，用CH2Cl2转移残留物至小瓶中，氮气流下蒸气浴挥干，备用。
（3）衍生物的制备
将200μL己烷及200μL三氟乙酸（TFA）加入含有样品残留物的小瓶中，涡流混合器上振摇5～10sec，40℃水浴中加热10min，通氮气加热挥发至干，制成的衍生物加入2mL水-乙腈（75:25）充分振荡，供液相色谱分析。
标准AFM1的衍生物制备：加200μL己烷及50mL三氟乙酸（TFA）于小瓶混合，加入50μL AFM1标准工作溶液，振摇5～10sec，如前所述样品的衍生物同样处理。
（4）检测
用峰高或峰面积作标准曲线，结果应保证线性关系，AFM1的保留时间为4～5min。根据峰高或峰面积、标准溶液浓度、进样体积、样品的总体积来计算出样品中AFM1的浓度。该方法的灵敏度为0.01～0.5μg/L，回收率在80%～100%之间。
免疫亲和柱法
原理
试样经过离心、脱脂、过滤后，滤液经过键合有AFM1特异性单克隆抗体的免疫亲和柱净化，AFM1被柱吸附，先用某一溶剂洗涤杂质，再用洗脱液将AFM1洗下，得到较纯的AFM1洗脱液，最后结合荧光光度计或高效液相色谱仪进行AFM1含量的测定。
分析步骤
（1）样品预处理
液体牛乳及牛乳制品，取50mL样品，加入1.0gNaCl，4000r/min离心10min，移取下层（上层脂肪层），用玻璃 纤维滤纸过滤备用。固体奶粉及制品，称取5.0g样品，用50mL130℃～ 60℃热去离子水溶解混匀，以下同液体牛乳预处理方法。
（2）柱净化
先将免疫亲和柱与玻璃注射器连接好，准确加入10mL预处理的澄清滤液，接上空气压力泵，调节压力使溶液以3～6mL/min的流速通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体，用10mL甲醇：水（1:9）清洗柱子2次，弃去全部流出液，然后准确加入1.0mL甲醇：水（8:2）洗脱已免疫结合于柱上的AFM1，流速调整为1～2mL/min，收集洗脱液于玻璃试管中，备进一步仪器检测用
检测
（1）光光度计法
首先在激发波长360nm，发射波长450nm波长下进行荧光光度计的校准，绿色标定管为0，红色标定管 为2.0，黄色标定管为1.0±0.2，然后于50mL AFM1显阴性的样品中添加AFM1系列标准溶液（浓度分别为0、0.1、0.5、1.0μg/L）按上述分析步骤进行分离纯化得到洗脱液，各加入1mL 0.002%溴溶液与AFM1产生衍生物，于荧光光度计中测定荧光强度，绘制AFM1标准浓度与荧光强度的标准曲线。最后样品洗脱液加入溴溶液衍生后，测定荧光强度，通过标准曲线计算样品中AFM1含量。
（2）高效液相色谱法
洗脱液取10～20μL于高效液相色谱仪进行荧光检测，外标法定量。
酶联免疫吸附法
原理
该方法结合了抗原抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化显色反应。首先将抗AFM1抗体包被于固相的聚乙烯微孔上，加入作为抗原的AFM1标准品或含AFM1的样品，同时加入AFM1酶结合物，与抗体进行免疫竞争反应，然后加入酶基质：显色剂进行显色，通过标准品孔、样品孔的颜色深浅来确定样品中AFM1的含量。
分析步骤
（1）样品处理
牛奶样品：将50ml含脂牛奶降温至10℃以下，3500r/min离心10min，用吸管吸弃上层脂肪层，取下层牛奶液 作为待测液。奶粉样品：称取5g奶粉于100ml三角瓶中，加入50ml蒸馏水振摇5～10min混匀，以下步骤同上述牛奶样品处理方法。
（2）试剂准备
抗体：将小分子量的AFM1通过化学合成偶联一高分子量的蛋白（BSA，OV，KLH等），制备完全抗原，然后免疫家兔2～3个月，期间加强免疫3～5次，最后从家兔血液中提取抗AFM1的免疫球蛋白（即多克隆抗体）。
酶标抗原：将AFM1通过化学合成，在“桥连剂”的作用下结合上酶蛋白（常用辣根过氧化物酶），经提纯后冷冻干燥得到AFM1酶结合物。
（3）检测
将抗AFM1抗体包被于微孔板上，4 ℃过夜，封闭；每孔中加入AFM1标准溶液或样品待测液，然后加入AFM1酶结合物，37℃反应30min；洗板后每孔中加入酶基质和显色剂，37℃显色15min；目视法或仪器法测定；通过绘制标准曲线计算样品中AFM1的含量。
检测方法比较
上述四类检测方法是目前国内外分析测定AFM1的最主要方法，主要特点见表
注：a：乳粉；b：牛乳
综上所述：需提取净化的分析方法样品前处理操作烦琐，复杂，费时，劳动强度大。TLC的特异性较差，灵敏度也相对较差，AFM1标准品浓度较高，潜在的污染性较高，HPLC所需仪器设备投资大，操作技术要求高，净化柱消耗较多，检测成本较高，免疫亲和柱特异性较好，但需结合HPLC仪和荧光光度计才能定量检测，检测技术要求和成本较高，而ELISA法相比而言，操作简便，快捷，污染较小，灵敏度也较高，适合批量样品的普检和筛选，特别是研制成功的试剂盒，给检测人员带来很大的方便，同时，也节省了成本，符合目前国际上检测领域的发展方向。
安全信息
安全术语
S22：Do not breathe dust.
不要吸入粉尘。
S36/37/39：Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face protection.
穿戴适当的防护服、手套和眼睛/面保护。
S45：In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the lable where possible).
发生事故时或感觉不适时，立即求医（可能时出示标签）。
S53：Avoid exposure - obtain special instructions before use.
避免接触，使用前获得特别指示说明。
风险术语
R11：Highly flammable.
高度易燃的。
R20/21/22：Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
吸入、与皮肤接触和吞食是有害的。
R26/27/28：Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
吸入、与皮肤接触和吞食有极高毒性。
R39/23/24/25：Toxic : danger of very serious irreversible effects through inhalation, in contact with skin and if swallowed.
有毒的：经吸入、与皮肤接触和吞食有极严重不可逆作用危险。
R40：Possible risks of irreversible effects.
可能有不可逆作用的风险。
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