绿色荧光蛋白

荧光标记物

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（GFP）指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。

名词简介

绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（GFP）指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。这种蛋白质最早是由下村脩等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。

在维多利亚多管发光水母中发现的野生型绿色荧光蛋白，395nm和475nm分别是最大和次大的激发波长，它的发射波长的峰点是在509nm，在可见光谱中处于绿光偏蓝的位置。绿色荧光蛋白的荧光量子产率（QY）为0.79。而从海肾(sea pansy)所得的绿色荧光蛋白，仅在498nm有一个较高的激发峰点。

在细胞生物学与分子生物学中，绿色荧光蛋白(GFP)基因常用做报告基因(reporter gene)。绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子)上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。通过基因工程技术，绿色荧光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组，在后代中持续表达。现在，绿色荧光蛋白(GFP)基因已被导入并表达在许多物种，包括细菌，酵母和其他真菌，鱼（例如斑马鱼），植物，苍蝇，甚至人等哺乳动物的细胞。

发展历史

1962年，已经有文献报道科学家从多管水母属的发光型水螅水母（luminous hydromedusan Aequorea）中提取到了具有生物发光性质的蛋白质。到了上世纪70年代，对生物发光的现象才有了一些新的进展。有科学家研究了多管水母属生物发光系统的分子内能量转移。到了九十年代初，科学家才克隆到GFP的cDNA，并且研究了其表达的氨基酸序列，发现 gfp 10 cDNA 编码238个氨基酸肽段。研究A. victoria GFP 基因克隆，发现GFP基因上面有三个限制性酶切位点。这对后续科学家了解其结构有很大的帮助。

1994年2月，M. Chalfie 等人创造性的将GFP分别在Escherichia coli和Caenorhabditis elegans细胞中表达，并得出结论由于GFP发光并不需要其他底物或者共同作用因子，所以GFP的表达可以用来在活体中监测基因表达和蛋白质的定位。从那以后的一段时间内，有无数的研究者投入到GFP相关的研究。就在 M. Chalfie 的报道过去一个月左右，Tsuji 等人就在E. coli中融合表达了GFP 蛋白，并且 GFP 在生物体中的激发光谱和发射光谱与自然条件下没有明显区别。由于 GFP 在生物体中的荧光强度不够强，因此很难应用到实际的科学研究中。1995年，Tsien 等人提升了 GFP 发光强度，极大的推动了 GFP 在生物学研究的应用。紧接着在1996年8月 F. Yang 等人就解析出了GFP的分子结构，GFP蛋白是圆桶状，由11个β-折叠形成外周，里面有一个α-螺旋，圆桶的两端是一些不规则卷曲。同年9月，Tsien 等人就解析出了GFP的晶体结构，并阐明其发光原理。还有一些科学家通过制造突变体来筛选更优的GFP，比如：对pH敏感的GFP、专门应用于植物细胞研究的GFP，等等。除了优化GFP之外，很多科学家开拓思维，将GFP蛋白的应用推广到很多研究领域，2002年，David A. Zacharias 等人就将GFP蛋白应用到膜蛋白的研究。同年，GFP蛋白甚至被做成了Zn生物探测器。

结构

野生型绿色荧光蛋白，最开始是 238 个氨基酸的肽链，约 25KDa。然后按一定规则，11 条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏；圆柱中，α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。发色图被围在中心，能避免偶极化的水分子、顺磁化的氧分子或者顺反异构作用与发色团，致使荧光猝灭。

荧光是荧光蛋白最特别的特点，而其中的发色团起着主要的作用。在 α-螺旋上的 65、66、67位氨基酸——丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸经过环化、脱氢等作用后形成发色团。有意思的是，发色团形成过程是由外周栅栏上的残基催化，底物只需要氧气。这暗示绿色荧光蛋白被广泛用于不同物种的潜力：在不同物种中能独立表达成有功能的蛋白，而不需要额外的因子。不过，现在依然在讨论准确的过程。

发色团上的共轭 π键能吸收激发光能量，在很短的时间后，以波长更长的发射光释放能量，形成荧光。

应用

由于荧光蛋白能稳定在后代遗传，并且能根据启动子特异性地表达，在需要定量或其他实验中慢慢取代了传统的化学染料。更多地，荧光蛋白被改造成了不同的新工具，既提供了解决问题的新思路，也可能带来更多有价值的新问题。

荧光显微镜

主条目：荧光显微镜

GFP和它的衍生物的可用性已经彻底重新定义荧光显微镜，以及它被用来在细胞生物学和其他生物学科的方式。其中，最令人兴奋的就是用于超分辨显微镜成像。

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