M13噬菌体

丝状噬菌体

M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链 DNA分子，长6407个核苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。

菌体介绍

M13DNA的复制起始位点定位在基因间隔区内。但是基因间隔区的有些核苷酸序列即使发生突变、缺失或插入外源DNA片段，也不会影响M13DNA的复制，这为M13DNA构建克隆载体提供了条件。

其中M13mp系列对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因，可容纳外源DNA300-400bp，可用于制备DNA测序时用的单链模板和核酸探针。

M13 噬菌体的生物学 M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染F+（含F质粒，能产生性菌毛）的大肠杆菌。感染宿主后通常不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。但生长水平比未感染组低。

M13 噬菌体的基因组为单链 DNA （+DNA），由 6407 的碱基组成。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 以及基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。

M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因 Ⅱ，Ⅴ 和 Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和 Ⅺ），结构蛋白（基因 Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和 Ⅸ）。所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。基因组 DNA 为正链，按基因 Ⅱ 至基因 Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。

在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA），即 RF DNA 。通过 θ 复制方式， RF DNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。

当基因 Ⅱ 蛋白在亲代 RF DNA 的正链特定位点上产生一个切口时，便启动噬菌体基因组进行滚环复制。此时，在大肠杆菌的 DNA 聚合酶 Ⅰ 的作用下，以负链为模板在切口的 3' 末端加入核苷酸，并持续 DNA 的合成，用新合成的 DNA 替换原有的正链。当复制叉环绕模板整整一周时，被取代的正链由基因 Ⅱ 产物切去，经环化后形成单位长度的噬菌体基因组 DNA 。在感染开始的 15～20 分钟内，这些子代正链在宿主细胞酶的作用下，又转变成 RF DNA ，然后以之为模板继续转录并继续合成子代正链 DNA 。当感染细胞内累计有 100-200 个 RF DNA 时，细胞内也产生了足够的单链 DNA 结合蛋白，即基因 Ⅴ 蛋白。该蛋白可以抑制翻译活性，特别是抑制基因 Ⅱ mRNA 的翻译，并且强烈地结合在新合成的正链 DNA 上，阻止其转化成 RF DNA 。此时， DNA 的合成几乎只产生子代正链 DNA 。另外，基因 Ⅹ 蛋白和基因 Ⅴ 蛋白也是噬菌体特异 DNA 合成的强力抑制子，从而限制感染细胞内 RF DNA 的数量。结果，感染细胞内 RF DNA 的数目和子代正链 DNA 的产生速率都能保持适度。

成熟噬菌体颗粒由 11 个病毒蛋白中的 5 个组成，至少 4 个其他蛋白（如基因 Ⅰ 、Ⅳ 和 Ⅺ 蛋白，以及宿主的硫氧还蛋白（thioredoxin））对噬菌体颗粒的组装和分泌是必须的。

M13没有包装限制：

构建

单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。

（1）载体的插入位点

在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因 Ⅱ/Ⅳ 和基因 Ⅷ/Ⅲ 之间）。基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因 Ⅷ 和基因 Ⅲ 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。基因 Ⅹ 也可用来克隆外源片段。

（2）M13 噬菌体载体组成

所使用的 M13 噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的 mp 系列载体，以基因 Ⅱ 和基因 Ⅳ 之间的区域作为外源 DNA 插入区。

mp 载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体（M13mpl）改造而来的。在 M13mpl 载体中，间隔区内的 HaeⅢ 位点插入了一小段大肠杆菌 DNA ，引入 α 互补筛选。

（3）M13载体系列

① M13载体系列的命名：M13mpn，n代表系列数字。

② 对M13mp1的改进：加上常用的酶切位点。如B. Gronenborn和J. Messing1978年把LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点，构建成M13mp2。

③ 对M13mp2的进一步改进产生了M13mp系列载体。在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19分别对应于pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19。

（4）M13mpl8 和 M13mpl9

M13mpl8 和 M13mpl9 这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。 M13mpl8 和 M13mpl9 DNA 的全序列已经测定完成，这两种载体只是在 lacZ 区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。

当 RF DNA 被两种不同的限制酶切割以后， M13mpl8 和 M13mpl9 轻易不能重新环化。仅当连接混合液中含有带匹配末端的外源双链 DNA片段时，方可闭合成环。这一片段在 M13mpl8 和 M13mpl9 中将以两个互为相反的方向插入。这样一来，在 M13mpl8 的正链中含有外源 DNA 双链的其中一条链，而在 M13mpl9 正链中则含有外源 DNA 的另一条链，即 M13mpl8 重组体的子代噬菌体内含有外源 DNA 的一条链， M13mpl9 重组体的子代噬菌体内则含有它的互补链。故用 M13mpl8 和 M13mpl9 作为一对载体，就可能用一个引物（通用引物），从所插入 DNA 片段的任一端开始，测定互为相反的两条链的 DNA 序列，并可制备只与外源 DNA 的任意一条链互补的 DNA 探针。

优点

（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段。

（2） Xgal显色反应，可供直接选择。

（3）无包装限制，克隆能力大。

（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（子代M13噬菌体中包含的是单链+DNA）。

缺点

① 插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降。

② 实际克隆能力小于1500bp（虽无包装限制，并非无限包装）。

宿主菌

由于 M13 噬菌体通过 F 质粒编码的性纤毛进入宿主细胞内，故只能用雄性细菌来增殖病毒。 Messing 及其同事已经构建了许多携带 F' 质粒并便于 M13 载体进行基因操作的多种大肠杆菌菌株，其中最重要的遗传标志有：

（1） lacZ D Ml5 lacZ 基因缺失突变体。

（2） D（lac-proAB）lac 基因缺失突变体。

（3） lacIq lacI 基因的突变体。

（4） proAB 细菌染色体上脯氨酸生物合成酶类的编码区域。

（5） traD36 抑制 F' 因子接合转移的突变。

（6） hsdRl7 与 hsdR 4 对大肠杆菌 K 株 Ⅰ 类限制 - 修饰系统失去限制活性但仍保留修饰功能的突变体。

（7） recA1 大肠杆菌重组酶基因。

（8） supE 琥珀抑制基因。

在 M13 噬菌体载体中进行克隆时常用的宿主菌株如下。

JM101 supE D （lac-proAB）[F'traD 36 proAB + lac I q lacZ D M15]

JM105 JM101/ hsdR 4

JM107 JM101/ hsdR 17

JM109 JM101/ hsdR 17 recA1

TG1 JM101/ hsd D5（不修饰不限制）

XL1-Blue supE lac- hsdR 17 recA1 [F' proAB + lac I q lacZ D M15]Tn 10 （Tet r）