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体外转录

DNA转录技术

转录通常发生在生物体内，如果我们将含有RNA转录酶、NTP等条件，在体外无细胞系统中，用DNA作为模板，模仿体内转录过程生成RNA，这样的技术则能够控制转录的基因、转录的过程和转录后RNA的用途，该技术被称为体外转录。

转录条件
转录模板必须满足：
1. 在基因组全长克隆过程中，在正向引物5‘末端添加T7启动子序列；
2. 以T7启动子作为体外转录启动子，在启动子后面靶位序列连续带有3个G,转录效率最 高；
3. 在正向引物5/端添加一个帽子G,有利于提高体外转录RNA分子的侵染活性。
操作步骤
1. 提取cDNA质粒；
2. 线性化质粒：（利用单一的酶切位点线性化有利于转录）
3. 纯化质粒：（尽量避免RNase污染） ① 加等体积的Tris-苯酚：氯仿（1:1）到100μL限制内切酶消化体系，涡旋振荡20s, 13000g离心5min; ②上清转移，加入2倍体积无水乙醇和1/10体积的3M的醋酸钠（pH5.2），-20℃放置不少于2h或过夜放置; ③DNA质粒13000g离心5min ,并且用20μL H2O重悬，放于-20℃。
4. 体外转录：（根据以下组成配制反应液，轻轻混匀）
10*basal reaction buffer
2μL 5*accelerator solution
4μL 25mM rNTPs mixture
4.5μL RNase Inhibitor
0.5μL Template DNA
100ng-1μg Thermo T7 RNA polymerase
1μL Nuclease-free water
up to 20μL Total volume 20μL
5. 在37℃-42℃下放置2小时。
6. 转录产物可通过1%非变性琼脂糖来检测：取产物1μL,160V电压，结果应为两条带， 上为DNA模板，下为RNA 产物。
注意： 1. 模板DNA（环状或线型）：必须具有T7启动子位点。同时，模板应为RNase-free级。在 质粒提取过程中如使用了RNase,必须通过苯酚·氯仿处理等方法除去RNase。
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