核糖核酸酶

化学物品

指能水解RNA 磷酸二酯键的酶称核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)。不同的RNase其专一性不同，例如牛胰核糖核酸酶(RNase I)，它的作用位点是嘧啶核苷3’一磷酸与其他核苷酸之间的连接键，而核糖核酸酶T1(RNase T1)的作用位点是3’鸟苷酸与其他相邻核酸之间的5’一OH间的连键。

理化性质

核糖核酸酶，白色粉末。为具有球蛋白性状的一种蛋白质。溶于水、50%丙酮。此酶最适宜温度为60℃，85℃以上失去作用，最适宜的pH值为7.6。是催化核糖核酸水解的一种核酸内切酶，可使胞嘧啶核酸解聚。对胸腺核酸则无作用。用于生化研究。

作用与用途

核糖核酸酶能催化核糖核酸（RNA）的降解，现已能人工合成。据报道，核糖核酸酶能改变宿主细胞新陈代谢，抑制病毒合成，在体外能抑制流感病毒增殖，在鸡胚内能抑制痘苗、疱疹病毒形成。临床用核糖核酸酶每天肌注180毫克，对治疗流行性脑炎有益。

分类

（一）核糖核酸酶A

核糖核酸酶A（RNase A）来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶，可特异攻击RNA上嘧啶残基的3’端，切割胞嘧啶或尿嘧啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是3’嘧啶核苷酸和末端带3’嘧啶核苷酸的寡核苷酸。无辅助因子及二价阳离子存在时，核糖核酸酶A的作用可以被胎盘RNA酶抑制剂（RNasin）或氧钒一核糖核苷复合物（vanadyl—ribonuclosidecomplex，VRC）所抑制。RNase A的反应条件极广，且极难失活。在低盐浓度（0～100 mmol/l NaCl）下，RNase A切割单链和双链RNA、DNA：RNA杂交体中的RNA；当NaCl浓度为300 mmol/l。或更高时，RNase A就特异性切割单链RNA。去除反应液中的RNase A，通常需要蛋白酶K处理、酚反复抽提和乙醇沉淀。在分子克隆中，核糖核酸酶A的主要用途为：

①从DNA：RNA杂交体中去除未杂交的RNA区。

②确定RNA或DNA中的单碱基突变的位置。在RNA：DNA或RNA：RNA杂交体中，若存在单碱基错配，可用RNAse A识别并切割。通过凝胶电泳分析切割产物的大小，即可确定错配的位嚣。

③RNA检测。RNA酶保护分析法（RNase protection assay）是近年来发展起来的一种检测RNA的杂交技术。其基本原理是利用单链RNA探针，与待测的RNA样品进行杂交形成RNA：RNA双链分子，由于RNA酶可专一性地降解未杂交的单链RNA，而双链受到保护不被降解，经凝胶电泳可以确定目的RNA的长度。该方法灵敏度较Northern杂交法更高，并可进行较为准确的定量。选择适当的探针，还可进行基因转录起始位点分析及内含子（也称内元）剪切位点分析等研究。此法的灵敏度比核酸酶S1保护分析法高数倍。

④降解DNA制备物中的RNA分子。须使用无DNase的RNase（DNase I free RNase），市售的一般RNase A常含有DNase，可在100 retool/I Tris—HCI（pH 7.5）和15 mmol/l。NaCI溶液中100℃加热15 min，以去除之。

（二）核糖核酸酶T1

核糖核酸酶T1（RNase T1）来源于米曲霉（Aspergillus orjzae），它特异地作用于鸟嘌呤3’端磷酸，切割位点在鸟嘌呤的3’磷酸和相邻核苷酸的5‘羟基之问的磷酸二酯键，反应终产物为3’鸟苷酸和末端带3’鸟苷酸的寡核苷酸片段。RNaseTl的反应条件极广，且极难失活，其催化活性类似于RNase A。

在RNA酶保护实验中，RNase T1与RNase A联合使用，对RNA进行定量和作图；还可用于去除DNA：RNA杂交体中未杂交的RNA区。

（三）核糖核酸酶H

核糖核酸酶H（RNase H）最早是从小牛胸腺组织中发现的，其编码基因已被克隆到大肠杆菌中。它能特异地降解DNA：RNA杂交双链中的RNA链，产生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和单核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA或RNA。

在分子克隆中，核糖核酸酶H的主要用途是与大肠杆菌DNA聚合酶工和DNA连接酶一起参加cDNA克隆中第二条DNA互补链的合成。当用逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链之后，用RNase H部分消化mRNA：DNA杂交分子中的RNA，产生的RNA片段就像冈崎片段一样，作为大肠杆菌DNA聚合酶T的引物，以cDNA第一链为模板合成DNA，直到把mRNA全部代替。然后在DNA连接酶的作用下，封闭缺口形成双链cDNA。

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