光学分析

光学分析方法

光学分析方法（opticalmethodofanalysis）---根据物质发射或吸收电磁辐射以及物质与电磁辐射相互作用来对待测样品进行分析的一类方法。分3种类型：(1)基于发射原理的有发射光谱化学分析、火焰光度分析、荧光X射线光谱分析、荧光分析、原子荧光谱分析等；(2)基于吸收原理的有比色分析、比浊分析、红外线吸收光谱分析、原子吸收光谱分析等；(3)基于其他原理的还有X射线衍射分析、电子显微镜分析以及偏光分析等。

分类

光学分析可分为非光谱法及光谱法两大类方法。

非光谱法

非光谱法（或称一般光学分析法）检测被测物质的某种物理光学性质，进行定量、定性分析的方法。如折射法、旋光法、园二色散法及浊度法等。

光谱法

光谱法利用物质的光谱特征，进行定性、定量及结构分析的方法称为光谱法或光谱分析法。按物质能级跃迁的方向，可分为吸收光谱法（如紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、核磁共振波谱法等）及发射光谱法（如原子发射光谱及荧光分光光度法等）。按年能级跃迁类型，可分为电子光谱、振动光谱及转动光谱等类别。按发射或吸收辐射线的波长顺序，分为γ射线、X射线、紫外、可见及红外光谱法、微波谱法以及电子自旋共振波谱法、核磁共振波谱法等。按被测物质对辐射吸收的检测方法的差别（在明背景下检测吸收暗线或是在暗背景下检测共振明线）可分为吸收光谱法与共振波谱法两类。按被测物质粒子的类型，可分为原子光谱、分子光谱及核磁共振波谱等。

荧光分析法

荧光分析法是DNA检测技术中最常用的检测方法。其原理为：在DNA靶序列上标记荧光染料，与DNA探针杂交后，荧光杂交信号可通过荧光扫描仪或激光扫描共焦显微镜获取。此法成熟稳定，但所用的扫描仪器较为昂贵，成本较高，而且荧光在空气中易被淬灭。荧光检测法除在DNA探针中或待测靶基因中标上荧光标记物外，也可在DNA杂交后加入荧光标记物。通过测定荧光标记嵌入DNA双螺旋间所导致的荧光信号的变化，检测DNA。例如，Bier等以花青二聚体YOYO及Picogreen作为与DNA双链紧密亲合的荧光嵌入剂，由于与DNA杂交体间的双嵌入作用，使得完全配对、单碱基错配及两个以上不匹配所产生的荧光信号有明显不同，从而能够明显区分不同DNA序列，对目的基因的检出限达到300pg/mL，循环再生60次以后，仍能有很好的灵敏度。Krull等以共价固定在石英光纤表面的DNA探针与溶液中的靶基因杂交后，与荧光嵌入染料溴乙啶（EB）反应，根据荧光强度与溶液中互补DNA的量的正比关系进行分析，可检测出86μg/L的DNA。用热缓冲溶液洗去EB和另一条链后，可重复使用，储存一年后活性不变。

时间分辨荧光分析法

时间分辨荧光分析法（TimeResolvedFluorescence，TRF）是在荧光分析基础上发展起来的另一种DNA检测技术。以常规荧光分子为标记物的传统荧光检测由于受到散射光、不同来源的背景荧光以及荧光淬灭等因素的影响，分析灵敏度一般仅为10^8～10^11mol/L。而某些稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，可消除背景荧光的干扰，因此产生了时间分辨荧光分析法。由于荧光发射峰窄、Stokes位移大和比背景荧光长得多的荧光寿命，TRF具有很高的分析灵敏度、宽阔的测量范围、优良的分析精密性和对多个待测物同时检测的能力。时间分辨荧光分析一般采用镧系元素螯合物作为示踪物。随着纳米技术的发展和应用，人们用铕螯合物染色的苯乙烯纳米粒子作为标记物，其测量范围和可靠性均得到提高。本课题组研究了在纳米金上修饰铕配体化合物组装层，通过铕离子的选择性配合与解离实现时间分辨荧光的调控，可望用于高灵敏的DNA标记检测。将时间分辨荧光技术应用于原位合成的DNA芯片检测，能很好地区分杂交正错配。

分子信标技术

分子信标技术是荧光分析方法在DNA检测领域的又一延伸。分子信标的概念是1996年由Tyagi等提出的。分子信标是一段与特定核酸互补的DNA探针，空间结构上呈“发夹”结构，其中环序列是与靶DNA互补的探针；茎的一端连接上一个荧光分子，另一端连上一个淬灭分子。当靶序列不存在时，分子信标呈“发夹”结构，茎部的荧光分子与淬灭分子非常接近（7～10nm），荧光分子发出的荧光被淬灭分子吸收，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，形成稳定的双链体线性结构，此时荧光分子与淬灭分子分开，产生可被检测的荧光信号。分子信标技术具有背景信号低、灵敏度高、特异性强等优点，在DNA检测中有着广阔的应用前景。分子信标技术已应用于PCR靶标的实时荧光定量检测。Perlette等在袋鼠肾细胞质中注入分子信标，实时检测了活细胞中的RNA及RNA/DNA杂交过程。通过选择不同的荧光分子-淬灭分子对，可设计出多色分子信标，荧光系统检测到不同颜色的荧光，可实现多个靶序列的同时检测。另外，可利用金表面对荧光的淬灭作用，将荧光标记的“发夹”分子固定在金表面，没有靶序列时荧光被金表面淬灭，有靶序列杂交后产生荧光。

实际上，分子信标是一种基于荧光能量转移（FRET）的技术。荧光能量转移是指当荧光给体和受体间的分子距离足够近时，发生分子间的能量转移，荧光从一个分子向另一个分子转移。因为DNA的存在可影响体系的能量转移，引起荧光强度的改变，荧光能量转移技术在DNA检测中有着广泛的应用。高峰等研究了吖啶橙-罗丹明B二聚体能量体系作为荧光探针用于DNA的测定。Bazan等在带正电的共轭聚电解质（cationicconjugatedpolymers，CCP）中加入荧光标记的肽苷酸（PNA-C*），由于PNA本身不带电，不会和共轭聚电解质发生作用。当溶液中加入和PNA互补的DNA时，DNA带有很强的负电荷，会和带正电的共轭聚电解质形成复合物，同时DNA和荧光标记的肽苷酸杂交，形成共轭聚电解质-DNA-（PNA-C*）的三元复合物，拉近了共轭聚电解质和荧光探针C*荧光强度即可判断出是否有待测DNA。

半导体量子点

最近几年以来，半导体量子点（quantumdot，QD）作为荧光探针标记物的应用开辟了生物荧光检测的新领域。量子点是一类由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素组成的无机荧光纳米粒子，以CdS、CdSe、CdTe、ZnS等的研究为多。与传统的荧光探针相比，纳米晶体的激光光谱宽，同一种激发光同时激发多种量子点，可发射出不同波长的荧光；量子点的发射波长可通过控制粒径的大小和组成材料来改变，因而可获得多种可分辨的颜色；量子点的发射峰窄而对称，重叠小，相互干扰小；并且量子点的光化学稳定性高，没有荧光染料的光褪色现象。Robelek等将生物素标记的靶DNA分别与亲和素标记的量子点QD565、QD655结合后，与3×4阵列的DNA探针杂交，进行了DNA的定性定量检测。Zhang等利用两种不同荧光波长的量子点与DNA杂交体系相结合，发展了一种均相快速检测DNA的方法，灵敏度可达5×10^15mol/L。更多的研究者将荧光量子点与分子信标技术结合起来。Kim等将CdSe/ZnS量子点作为荧光基团，与DABCYL淬灭基团分别结合在“发夹分子”的两端。其研究表明，量子点与淬灭分子之间的荧光能量转移可应用于核酸杂交研究。Zhou等将Alexa594标记的双链DNA与CdSe/ZnS量子点连接，其荧光共振能量转移效率可达88%。Krull等在CdSe/ZnS量子点表面固定DNA探针，分别与Cy3和Alexa647荧光标记的靶序列杂交，量子点与荧光标记物之间的荧光能量转移使DNA的单色或多色荧光检测成为可能。

化学发光法

定义

化学发光（Chemiluminescence，CL）是化学物质在特定化学反应中产生光辐射的现象。当物质分子通过化学反应吸收能量，从基态跃迁到激发态，物质本身从激发态回到基态时伴有光的产生，即为化学发光。

表现方式

根据激活方式的不同，主要有电致化学发光（ECL）和生物化学发光（BCL）DNA检测。Fang等将DNA探针固定于包覆了[Ru(bpy)3]2+的SiO2纳米颗粒表面，与电极表面的靶DNA杂交后测定其电化学发光信号，检测限可达1.0×10^-13mol/L。生物化学发光一般采用酶激活化学发光。DNA样品与探针杂交后，与化学发光底物酶结合。随即加入化学发光底物，由于化学发光底物酶可激活底物发光，便可通过探测化学发光强度得知分子杂交情况。Maier等设计了一种以荧光底物AttophosTM代替化学发光底物的方法。Attophos在化学发光底物酶催化下，受激发射荧光可被显著放大。

光纤传感法

光纤传感DNA检测

激发光在光纤内以全反射方式传输时产生倏逝波，激发附着在纤芯表面的荧光物质，所产生的荧光信号仍经光纤返回，由CCD相机接收，从而可检测纤芯表面荧光标记的生物分子。光纤传感DNA检测具有实时检测、测量准确、特异性高的优点，成为研究者关注的热点。

新型光纤传感器

Epstein等将光纤表面蚀刻后固定多个微球，微球上修饰有DNA探针，与荧光标记的靶DNA杂交后，可检测多个基因序列。Zhang等报道了基于化学发光的DNA光纤传感检测。DNA探针固定在光纤表面，与辣根过氧化物酶（HRP）标记的互补DNA杂交，然后检测其化学发光强度。Liu等将分子信标固定在光纤表面，对靶DNA进行无标记检测，灵敏度为1.1nmol/L。Kajikawa等将纳米金颗粒固定于光纤表面，制成一种新的光纤传感器。金表面的巯基DNA与靶DNA杂交后，纳米金周围的折射率改变，引起光吸收带的红移和吸收强度的改变，利用这种方法同样可以进行DNA的无标记检测。

比色法一

纳米技术与DNA结合

纳米技术与DNA检测技术的结合为比色基因检测方法的发展提供了基础。纳米金由于制备简单、粒径可控、生物兼容性好等优点在DNA检测中得到了越来越广泛的应用。纳米金颗粒在盐溶液中很容易聚集，纳米金溶液的颜色对聚集程度非常敏感。Mirkin等将互补的靶DNA加入纳米金标记的探针溶液中，靶序列与探针杂交后在溶液中形成以DNA杂交体为纽带的多个Au纳米粒子构成的纳米金/寡核苷酸网状聚集物，使纳米金颗粒间的距离拉近，溶液颜色由红色变为蓝色。这一方法的检测灵敏度可达10fmol/L。在高浓度靶分子存在下甚至用肉眼就可直接观察到结果。根据不同直径的金纳米粒子产生的散射光不同，可进行寡核苷酸阵列的多色标记和检测。

金标银染法

在比色法中，还有一种检测方法——金标银染法得到了很快的发展。这种检测方法与荧光检测方法相比，选择性可高出3倍，而灵敏度则可提高100倍之多。金标银染基因检测的基本原理，DNA探针末端标记有纳米金颗粒，杂交后，银离子在金颗粒表面沉积，被还原为单质银而呈现出黑色的银染信号。这种信号用肉眼就可观察到，如果用普通的扫描仪扫描后再用相关软件分析信号的灰度，即可得到准确的灰度值。总之，比色分析法具有无辐射，检测仪器简便的优点，并且没有荧光淬灭，近年来已越来越多地用于DNA检测的研究。

比色法二

基本要求

以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。

方法

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律（A=εbc）为基础。常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。

光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

共振法

基本内容

表面等离子共振（SurfacePlasmonResonance，SPR）是一种物理光学性质，它是一种沿着金属和电介质界面传播的电磁波。光以一定的角度入射到界面时，若在界面发生完全内反射，会产生衰减波。若衰减波在金属表面与自由电子耦合，则发生表面等离子体激元共振，光的反射率达到最小，此时的入射角称为表面共振角（SPA）。SPA对与金属表面邻近的介质的折射率的变化很敏感，金属表面邻近介质的折射率不同，SPA就会不同，即使是同种材料的电介质，SPA也会因为电介质在金属表面的量的不同而变化。ssDNA探针在金属表面的固定以及靶序列与探针序列的杂交都会引起金属表面邻近的电介质改变。因此，SPR可用于基因检测。由于表面等离子共振技术可用来测量金属薄膜表面的待测物浓度变化，样品无需预先进行任何标记等前处理，故可用于即时（real-time）分析。

被分析物溶液流过固定有“‘受体’的传感片表面，若发生作用而相互结合则会引起表面物质质量改变，而折射率与质量成正比，所以折射率改变，欲保证SPR发生，共振角也得随折射率改变，改变大小与结合的被分析物质量成正比。因此通过分析共振角，就可以分析分子之间的相互作用。Jordan等利用多层链亲和素/DNA系统放大了核酸杂交的SPR信号。利用RNaseH酶选择性地破坏RNA/DNA双螺旋中的RNA这一特性，Terry等[25]对DNA进行SPR成像检测，将灵敏度放大到1fmol/L。另外，利用纳米金粒子对表面激元共振的增强作用，可以使金标后的DNA检测灵敏度提高1000倍.SPR基因检测的突出优点是可以进行无标记的DNA杂交反应的检测，可以进行原位和实时的在线检测。SPR检测发展。方向一是检测仪器的微型化、集成化，比如TI公司研制的一种TISPR-1型传感器，就是典型的例子；另一方向是SPR的成像研究，为DNA杂交乃至生物反应、分子动力学的研究和测试提供了新的手段。

分类

光学分析可分为非光谱法及光谱法两大类。

非光谱法（或称一般光学分析法）检测被测物质的某种物理光学性质，进行定量、定性分析的方法。如折射法、旋光法、园二色散法及浊度法等。

光谱法---利用物质的光谱特征，进行定性、定量及结构分析的方法称为光谱法或光谱分析法。按物质能级跃迁的方向，可分为吸收光谱法（如紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、核磁共振波谱法等）及发射光谱法（如原子发射光谱及荧光分光光度法等）。按年能级跃迁类型，可分为电子光谱、振动光谱及转动光谱等类别。按发射或吸收辐射线的波长顺序，分为Y射线、X射线、紫外线、可见及红外光谱法、微波谱法以及电子自旋共振波谱法、核磁共振波谱法等。按被测物质对辐射吸收的检测方法的差别（在明背景下检测吸收暗线或是在暗背景下检测共振明线）可分为吸收光谱法与共振波谱法两类。按被测物质粒子的类型，可分为原子光谱、分子光谱及核磁共振波谱等。

光学分析方法（optical method of analysis ）---利用物质的光学性质进行化学分析的方法。分3种类型：（1）基于发射原理的有发射光谱化学分析、火焰光度分析、荧光X射线光谱分析、荧光分析、原子荧光谱分析等；（2）基于吸收原理的有比色分析、比浊分析、红外线吸收光谱分析、原子吸收光谱分析等；（3）基于其他原理的还有X射线衍射分析、电子显微镜分析以及偏光分析等。

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