共振拉曼光谱

生物学术语

当激发频率接近或重合于分子的一个电子吸收峰时,某一个或几个特定的拉曼带强度会急剧增加,甚至达到正常拉曼带强度的百万倍,并出现正常拉曼效应中所观察不到的、强度可与基频相比拟的泛音及组合振动,这就是共振拉曼效应(简称RRE)。高分辨的分光系统和灵敏的检测系统的发展,以及振动和电子振动偶合理论的进展,使人们能得到很多有关分子、离子的拉曼谱带强度与激发频率依赖关系的信息,这就是在正常拉曼效应基础上发展起来的共振拉曼光谱学。共振拉曼光谱学已成为研究和检侧有机和无机分子、离子、生物大分子,甚至活体组成的有力工具。

特点

拉曼效应是分子对入射光所产生的使其频率发生较大改变的一种散射现象。激光拉曼光谱主要有以下一些特点：

(1)每种物质(分子)都有自己的特征拉曼谱线，因此可用于表征这一物质。

(2)每一物质的拉曼频移(即入射频率与散射频率之差)与入射光的频率无关，拉曼散射是瞬时的，即入射光消失时，拉曼散射在 10-11～10-12S 后消失。

(3)拉曼谱线的线宽一般比较窄，并且成对出现，即具有同数值的正负频率差。在短波一边的称为反斯托克斯线，在长波一边称为斯托克斯线。

(4)拉曼频率位移的数值可以从几个波数(cm-1)到 3800 个波数。

(5)一般的拉曼频率是分子内部振动或转动的频率，有时与红外吸收谱所得的频率部分重合，并且波数范围也是相同的。

(6)拉曼谱线的强度和偏振性质，对于各条谱线是不同的。

(7)斯托克斯线和反斯托克斯线的强度比代表分子在基态与在第一激发态的布居数(population)之比，这个比值遵从玻尔兹曼分布定律，是热力学温度的函数，同时还与拉曼位移有关。

(8)在分子与作拉曼散射的同时，还有比拉曼散射强几个数量级的瑞利散射，其波长与入射光的波长相同。

(9)拉曼效应普遍存在于一切分子中，无论是气体、液体或固体。

优缺点

优点

与红外光谱学相比,共振拉曼光谱的突出优点在一卜`它能够选择性地增强与可见紫外电子吸收带相关的振动。从这种选择性增强及拉曼带固有的谱带较窄中常可得到比红外光谱更多的情况。由于共振拉曼光谱的选择定则与单光子吸收和发射光谱不同,又因共振拉曼带宽一般不依赖于中间被激发的转动一振动一电子态,故从共振拉曼光谱中得到的信息在很多情况下远远越过电子吸收与发光光谱。

缺点

共振拉曼光谱技术的缺点是设备费用较高,操作不如红外、紫外光谱技术方便,有时还会因荧光而得不到光谱图。另一个本身内在的缺点是:随着波数增大,共振拉曼光谱强度变弱,甚至记录不到,这是由于当用相当于或高于单、双或三键键能波数的激光照射样品时,样品吸收了光子,引起这些化学键的断裂,致使分子跃迁到某个解离连续态的几率大于散射最终态。

光谱技术

振拉曼效应是在拉曼的基础上引入共振吸收增强效应，即由于激发光的频率落在散射分子某一电子吸收带之内而产生的，所以共振拉曼光谱技术可使拉曼谱线强度显著增大，甚至可致 106倍。共振拉曼光谱可提供较低的检出限(对于某些组分为 10-6～10-8mol/L)而可用于痕量分析。因而，近年来共振拉曼光谱成为线性激光拉曼光谱技术中最为活跃的一个领域。共振拉曼效应可以很好地改善对复杂分子的拉曼测量的选择性。因为电子跃迁仅局限在复杂分子的一部分上，所以只有与分子中某生色团有关的带才能被增强。共振拉曼效应的特点是：

(1)某些拉曼线强度显著增大，可增到 106倍，同一分子的各种拉曼谱线强度增加不同，增强只限于与电子跃迁偶合的振动模式，也就是说那些在电子激发时平衡几何形状会有大的改变的振动将被增强；

(2)倍频与组频强度显著增加普通拉曼光谱中倍频或组频强度约为基频的1%，而有些物质共振拉曼光谱中，倍频可以接近基频的强度；

(3)可以观察到很多次倍频，退偏比出现异常值，ρ 可以无限大。

共振拉曼光谱的实验技术，原则上与自发拉曼光谱的技术相同，设备是基本一样的，但它也有一些特殊方面：

(1)要求光源的频率可调谐，至少在化合物的电子吸收谱区的长波部分可调谐，即在可见光和近紫外光谱区可调，以方便选择任意的激发频率，达到共振。

(2)激发光源的谱线宽度要尽可能的窄，谱线要很好的单色性，频率要稳定。

(3)激发光要尽可能强和会聚，这样可以减少样品对散射光的吸收损耗。

(4)光谱分析器(包括单色器和接受器)要尽可能灵敏和高分辨率。

应用

测定分子结构

共振拉曼光谱学与其他分子光谱学一样,是阐明原子、分子、离子以及结晶体系的工具。其特长是研究自由的或弱相互作用下的分子和多核离子的结构。

(1)利用共振拉曼光谱图上的泛音频率测定光谱常数。以往只有在简单分子的气体红外光谱中能观察到泛音级数而测得非谐常数。从很多物质(包括液体、固体)的共振拉曼图上能得到相当强的泛音带,可以从中精确地求出谐波频率和非谐常数,为确定电子基态势能曲线(势能面)提供重要依据。图（1）为固体四碘化钦的共振拉是光谱图。由该图可明显看出TiI4的一个全对称基频,,的十二个泛音带。

(2)根据激发轮廓判断电荷转移体系分子间的相互作用。拉曼谱带强度与激发频率之间有着依赖关系是人们对共振拉曼光谱感兴趣的主要原因之一。激发轮廓是用接近样品的电子吸收频率的激光(即激发频率)对拉曼谱带强度作图得到的曲线。用激光轮廓研究电子跃迁方面的报导很多。

(3)共振时得到新退偏振比是检测电子偶合的良好探针。正常拉效曼应中退偏振比与入射频率无关。而在共振拉曼效应中退偏振比可能随激发频率而变,这样得到的曲线称为退偏振比色散曲线,对电子偶合很灵敏。在共振拉曼散射中能得到退偏振比p>3/4,称为反常偏振,还有p趋于无穷的，称为逆偏振的谱带。

生物化学中的应用

（1）低浓度样品的检测：在研究生物大分子时,共振拉曼技术由于样品用量少和浓度低显示了优越性。图（2）为抗肿瘤药物在甲醇稀溶液中的共振拉曼图,可见浓度在10-5M/L就能得到清晰的光谱。若用正常拉曼方法则所需浓度为1-0.1M/L。因此用共振拉曼光谱法可以不加处理地得到人体体液的拉曼光谱图。

（2）非破坏性测定：有些很复杂的生化样品,如血红肮、叶绿素、胡萝卜素、维生素B,:等,在相当强的激光照射下不会变化,因此可以用来作非破坏性的测定,如检测活植物原样中的红细胞、番茄红素及卜胡萝卜素,菠菜叶绿体中的胡萝卜素类及叶绿素,细菌细胞色素等。

（3）选择性：共振拉曼光谱对某些拉曼带有选择性的增强,对研究大分子结构特别有利。这不仅简化了光谱,并常能对分子某些特定的部分结构提供有价值的信息。不少重要的生物分子具有特征的电子吸收带基团,适当地选择激发频率可以得到这些基团的增强共振带。这些基团的共振谱带对其周围的结构变化非常敏感,能成为生物基团的报告者。那些不含合适的发色团的大分子也常能在接上一个染料分子后,从比较联上的染料分子的拉曼光谱与未联前染料分子光谱的差别来了解电子跃迁受到环境的微扰,从而得到大分子的结构信息。

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