固氮酶

能够将氮分子还原成氨的酶

固氮酶是一种能够将氮分子还原成氨的酶。固氮酶是由两种蛋白质组成的：一种含有铁，叫做铁蛋白，另一种含铁和钼mo3+，称为钼铁蛋白。钼铁蛋白中含有7个铁，9个硫，1个钼，1个中心碳。

基本信息

1960年，人们获得了无细胞的固氮酶提取液，在此基础上，Carnahan和Mortenson等成功地实现了体外固氮。Bullen和LeComte进一步分离出固氮酶的两个组分钼铁蛋白(MoFe蛋白)和铁蛋白(Fe蛋白)。这两种蛋白单独存在时，都无固氮酶活性，只有二者整合在一起，形成复合体后，才具有固氮酶活性(因为这两种物质作为电子载体能够起到传递电子的作用）。生物固氮原理简介：生物固氮是固氮微生物特有的一种生理功能，这种功能是在固氮酶的催化作用下进行的。固氮微生物需氧，而固氮必须是在严格的厌氧微环境中进行。组成固氮酶的两种蛋白质，钼铁蛋白和铁蛋白，对氧极端敏感，一旦遇氧就很快导致固氮酶的失活，而多数的固氮菌都是好氧菌，它们要利用氧气进行呼吸和产生能量。

固氮酶结构

Fe蛋白

Fe蛋白由nifH基因编码。对多种生物固氮酶铁蛋白的一级结构的测定结果表明，Fe蛋白都不含色氨酸，酸性氨基酸的含量均高于碱性氨基酸，各属种间的同源性为45%～90%，说明铁蛋白的基本结构较为保守。

Fe蛋白是两个相同的亚基组成的γ2型二聚体。二聚体的分子量约为59～73kD(因菌种不同而差异)，每个亚基的分子量约30kD。两个亚基通过一个[4Fe-4S]金属簇桥连，每个亚基的核心是一个由8个β折叠片形成的平面，侧面与9条α螺旋相连。在二聚体两个亚基的界面之间还存在大量的氢键和静电作用。这些作用力很强，即使[4Fe-4S]簇被抽提，铁蛋白二聚体的结构仍能保持。

在Fe蛋白上有3种功能位点：[4Fe-4S]簇、MgATP结合-水解位点、ADP-R位点。前二者密切结合，关系到电子的传递。有的固氮生物(如巴西固氮螺菌)的Fe蛋白还含有ADP-R位点(ADP-核糖基化位点)，参与固氮酶活性的调节。在氨存在的情况下，由ADP-核糖转移酶催化铁蛋白的ADP-核糖基化，抑制固氮酶活性；相反，ADP-核糖糖基水解酶除去ADP-核糖，解除对固氮酶的抑制。

在固氮反应中，[4Fe-4S]簇改变氧还电势作为分子间电子传递的驱动力。反应首先由Na2S2O4、铁氧还蛋白、黄素氧还蛋白等电子供体提供电子将[4Fe-4S]2+还原为[4Fe-4S]1+，[4Fe-4S]1+再将电子传递给钼铁蛋白后，[4Fe-4S]1+再转化为[4Fe-4S]2+。传递一个电子要水解2个MgATP。

除了作为钼铁蛋白的专一性的电子供体外，铁蛋白还具有以下功能：参与钼铁蛋白M-簇(FeMoco)的生物合成，以及合成的FeMoco插入钼铁蛋白的过程，并且可能对固氮酶体系的表达具有调控功能。

MoFe蛋白

Kennedy等人通过SDS-PAGE法，发现钼铁蛋白含有两种亚基，已经确定其为异四聚体(α2β2)，分子量约220k～240kD之间(因不同来源而异)。α亚基分子量为55kD，由nifD基因编码，大小约为500个氨基酸，氨基酸序列的同源性在47%～66%，具有相当高的保守性。

在已知的α亚基氨基酸序列中，有5个Cys残基(Cys62、Cys88、Cys154、Cys183、Cys275)是绝对保守的，可能和钼铁蛋白中金属原子簇的生物合成有关。nifK基因编码的β亚基分子量为60kD，氨基酸序列与α亚基比较相似。α亚基和β亚基之间存在广泛的相互作用，它们构成一个近似轴对称的αβ，两个αβ二聚体以近似轴对称的方式交联起来，形成了α2β2四聚体。

在钼铁蛋白中含有M-簇和P-簇两种金属原子簇。P-簇是一类独特的[8Fe-7S]的原子簇，位于α和β亚基二聚体的界面上。它能够进行多种氧化还原态的变化，PN经过不同程度的氧化为P1+、P2+、P3+及PSUPEROX。这些不同氧化态的P-簇都具有独特的电子顺磁共振谱(EPR)特征，为研究P-簇的功能提供了有效的途径。P-簇是固氮酶反应中电子传递的中间体，负责接受和储存来自铁蛋白的[4Fe-4S]簇的电子并将电子传递到M-簇。M-簇位于钼铁蛋白的α亚基内，仅通过αCys275和αHis472两个氨基酸残基与蛋白主链相连。它由一个[4Fe-3S]簇和一个[1Mo-3Fe-3S]簇通过3个S原子与二者中的Fe连接而成的Mo1Fe7S9原子簇。FeMoco上连有一个高柠檬酸分子，高柠檬酸分子通过2个O原子与Mo连接。MoFe蛋白分辨率1.16的X-射线晶体衍射显示，FeMoco内还存在一个轻的原子，它以6个等同的键连接在[4Fe-3S]簇和[1Mo-3Fe-3S]簇的3个Fe原子，这个轻的原子可能是N。

MoFe蛋白在固氮酶催化氮气等底物过程中起催化、络合作用。铁蛋白中的[4Fe-4S]簇将电子传递给MoFe蛋白的P-簇，使其还原，然后P-簇再将电子传递给FeMoco，底物在此接受电子后被还原。可见，FeMoco是固氮酶的活性中心，FeMoco的结构以及其周围多肽环境的变化对固氮酶活性的影响是当前研究固氮催化机制的最活跃领域之一。

防氧保护机制

固氮菌在进化过程中，发展出多种机制来解决既需氧又防止氧对固氮酶的操作损伤的矛盾。

1、固氮菌以较强的呼吸作用迅速地将周围互不干涉中的氧消耗掉，使细胞周围处于低氧状态，保护固氮酶不受损伤。

2、在根瘤菌中，以豆血红蛋白与氧气结合的方式使豆血红蛋白周围的氧气维持在一个极低的水平。

3、有些固氮菌能形成一个阻止氧气通过的粘液层。

反应总式

固氮的过程中每个电子的传递需要消耗2~3个ATP，而且一般固氮生物在固氮的同时也会产生氢气，因此固氮的总反应式可写为：

此过程消耗16~24个ATP。

固氮酶的多样性

在Bishop等发现第二套固氮系统以前，人们一直认为，钼铁蛋白和铁蛋白组成的固氮酶系统是固氮生物中起固氮作用的唯一系统。Bishop在对棕色固氮菌的研究中，发现存在另外一种固氮酶系统，使生物体在缺乏Mo的条件下可以固氮生长。这种含钒固氮酶只在无Mo而有V的条件下表达，由VFe蛋白和Fe蛋白-2组成，被认为是一种“备份”的固氮酶系统。Fe蛋白-2由vnfH编码，分子量为64kD，结构和功能均与含钼固氮酶的铁蛋白类似；二者之间的同源性达90%。钒铁蛋白的结构特性和钼铁蛋白相似，但除α2β2外，还含有一个小的δ亚基，组成α2β2δ2六聚体。VFe蛋白含有一个与FeMoco类似的FeVco活性中心和一个与MoFe蛋白中具有相似波谱特性的P-簇。在催化氮还原的过程中，与含钼固氮酶相比较，含钒固氮酶的催化过程释放更多的H2，消耗更多的MgATP。但是，含钒固氮酶在低温条件下比含钼固氮酶更具有活性，从而在进化过程中得以保存。

第三套固氮酶系统是铁铁固氮酶，其固氮活性极低，由FeFe蛋白和Fe蛋白-3组成。Fe蛋白-3与含钼固氮酶系统中的Fe蛋白的氨基酸序列同源性只有60%；FeFe蛋白与VFe蛋白在α和β的氨基酸序列同源性为55%，与MoFe蛋白的同源性只有32%。这三套固氮酶分别由nif、vnf及其anf基因簇调控，它们的固氮能力表现为含Mo酶>含V酶>仅含Fe。

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