差异基因

基因在RNA水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下，表达有显著性差异的基因

差异基因（differential gene），是指一个基因在RNA水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下，表达有显著性差异的基因。在不同因素下基因突变或者甲基化等结构发生改变导致差异的基因。

定义

中文名字：差异基因

英文名字：Differential Gene

定义1：是指一个基因在RNA水平处在不同环境压力、时间、空间等方面下，表达有显著性差异的基因。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科），核酸与基因（二级学科）

定义2：在不同因素下基因突变或者甲基化等结构发生改变导致差异的基因。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科），核酸与基因（二级学科）

发展

人体基因组图谱好比是一张能说明构成每个人体细胞脱氧核糖核酸（DNA）的30亿个碱基对精确排列的“地图”。科学家们认为，通过对每一个基因在疾病中差异表达的测定，人们将能够找到新的方法来治疗和预防许多疾病，如癌症和心脏病等。该图非常形象地把基因家族的基因片段描绘出来。

Science和Nature等各大杂志上近几年也一直有刊登通过差异基因对生活、健康、疾病等进行研究的报道，专家学者通过差异基因来作为早期疾病的诊断标志物为人类医疗行业的进步做着不断的努力。

从PCR到新一代高通量测序，随着实验技术的不断进步，差异基因开始被越来越多的研究者所关注，医生不再停留在表型和蛋白层面，而是追溯他们的上游对核酸进行挖掘。

筛选方法

常用的技术有DD-PCR、GENE-FISHING、GENE CHIP、高通量测序等，简单介绍如下：

DDRT-PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT-PCR技术的基本过程如下：

①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA

②在逆转录酶作用下，以Oligo dT12MN为锚定引物将mRNA反转录成cDNA

③ 以cDNA为模板利用10一mer随机引物和锚定引物进行PCR扩增

④ 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR扩增产物，结合银染等显色方法获得平行材料间的差异cDNA片段，回收并再扩增差异片段

⑤Northern blotting检测差异cDNA片段是否为阳性片段

⑥克隆cDNA片段并测序

⑦ 根据测序结果筛选cDNA文库或使用RACE技术获得cDNA片段侧翼序列，进而获得其全长cDNA基因。

GeneFishing技术用来检测不同样品间的表达差异。该技术着眼于解决用来检测基因表达差异的方法所面临的问题，如芯片技术和差异显示技术。该技术的实验包括以下三个步骤，反转录PCR (RT) 和两步法PCR (GeneFishing PCR)。

第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一链。dT-ACP1引物的3′端与mRNA的多聚A互补。这样第一链cDNA包含了dT-ACP1引物 5´端的通用序列。

第二步: 把第一步得到的第一链cDNA稀释后和随机ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。随机ACP引物的3′端序列能有效的结合到第一链cDNA的某一部位。在第一步PCR时，通过控制条件只能使随机ACP的3′端特异的结合到第一链cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火结合到第一链cDNA。通过第一步PCR合成第二链cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互补序列，而其5′端包含了随机ACP的通用序列。

第三步: 来自第二步的PCR管的混合物在更严格条件下进行第二步PCR，这时使dT-ACP2和随机ACP能各自退火结合到第二步得到双链cDNA的3′ 端和5′端。既然第二链cDNA的3′端序列与随机ACP引物的通用序列互补，而其5′端与dT-ACP2的通用序列互补，这样保证了只扩增目标产物。

该技术特点如下：

(1) 无假阳性。GeneFishing技术鉴别的差异表达基因均可通过Northern Blot分析或RT-PCR证实！现有的DEG检测方法，例如生物芯片和差异显示技术的主要瓶颈就是假阳性的存在。无假阳性可以使研究者能快速辨别可信的差异表达基因。

(2) 无需PAGE（聚丙烯酰胺凝胶），琼脂凝胶法即足够。退火控制引物(ACP)极大地提高了PCR扩增的特异度和灵敏度，从而产生特异PCR产物。而且，GeneFishing 技术只需要少量的起始物质。PCR产物可以在标准的溴化乙啶染色的琼脂凝胶中被检测，因而省去了使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）的繁琐处理步骤。使用GeneFishing 技术在琼脂凝胶中产生的条带具有足够浓度，可以被Northern Blot方法检测。

(3) 无需昂贵的检测方法。放射性/荧光检测方法由于其成本和危险性而不能广泛应用。昂贵的检测方法是现今差别表达基因检测的另一缺点。因此，可以使用标准溴化乙啶染色的琼脂凝胶来进行检测是GeneFishing 技术的一个主要优势。

(4) 重复性保证。GeneFishing技术的所需反应试剂均由试剂盒提供。这样防止了由于使用旧的，不匹配的试剂而带来的变化，确保了可靠的重复性。

(5) 无需特殊技术。GeneFishing 技术是一种以PCR技术为基础的创新方法，简单易用。

(6) 快速经济。GeneFishing技术使得研究者可以在5小时内确认有效的差异表达基因，不必因为假阳性而浪费时间。相比之下，所有其他DEG筛选方法都需要大量的后续工作和时间来鉴别有效的差异表达基因。

(7) 大范围的PCR产物。每一个GeneFishing PCR反应产生从150bp至2kb长度范围的PCR产物，这不仅提高了鉴别差异表达基因的机会，还为预测基因功能提供了更多的有效序列信息。

基因芯片技术的原理类似我们日常所说的计算机芯片，只是在固体基质上的不是集成着各种半导体管，而是成千上万的基因探针，待分析的样品通过和芯片中已知序列的DNA片段碱基互补杂交，经过计算机的分析，从而确定待测核酸序列和性质，表现出基因表达量和一些序列本身的特性。该技术主要包括四个环节：芯片微列阵制备，样品制备，生物分子反应和信号的检测分析。制备方法主要是采用表面化学的方法或是组合化学的方法来处理固相基质，如玻璃片或硅片。在固体材料中刻出微滤栅、微通道，并加上微泵、微阀来控制流体。然后将探针以预先设计的顺序固定在固体基质上。微列阵制备技术主要有两种基本方法：原位合成法和点样法。

测序技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

应用

全转录组研究是一种被广泛应用的、从整体的层次研究材料中基因表达与调控的研究手段，在探索生命过程以及形形色色的生物学问题，如疾病发生等的研究中发挥重要的作用。以前的转录组研究主要侧重于对mRNA的研究，随着不同类型RNA分子的发现以及其重要生物学功能的揭示，转录组的研究内容也随之拓展。新一代测序技术以其高通量数据的产出为鉴定低丰度表达的转录本提供了机会，另一方面，文库构建技术的发展也使科研人员有机会更高效全面的捕获RNA分子。人们将有机会更全面深入地认识转录组，并在此基础上开展研究。

对一个病人的全基因组测序来发现他或她的疾病的起源还是不能作为常规的。但是，遗传学家正在努力靠近。发表在杂志American Journal of Human Genetics上的一份病例报告表明研究人员能将简单血液测试与基因组专业概要扫描相结合来诊断严重代谢性疾病。埃默里大学医学院和桑福德-伯纳姆医学研究所的研究人员使用全外显子组测序法在2004年出生的男孩身上来寻找导致糖基化作用紊乱的突变。负责这个男孩疾病的基因称DDOST，此基因的突变以前在其他糖基化作用紊乱病例中还没有被观察过。全外显子组测序法是读取部分基因组的一种更便宜、更快速但有效的策略，其中部分基因组是科学家们所相信的诊断疾病的最重要的。报告举例说明了全外显子组测序法正在进入医疗实践，这种测序法是在2011年首次被商业化地提供给临床诊断。埃默里大学遗传学实验室正准备开始将全外显子组测序法作为临床诊断服务进行提供。据估计，许多致病性突变（约85%）在编码蛋白的基因组区域内发现，那是细胞的工作机制。全外显子组测序法只读取人类基因组中编码蛋白的部分，剩下基因组余下的99%不读取。

新视角

以往对差异基因的研究停留在mRNA（信使RNA）和基因变异的层面上。近日，美日三个研究小组2012年2月12日在美国《自然—医学》Nature Medicine杂志同时发文，宣布已发现会引发肺腺癌的异常基因。据悉，在甲状腺癌等的治疗药物中，有些有望对该基因诱发的癌变具有抑制作用。

该异常基因名为“KIF5B-RET融合基因”，是由两个基因在某种原因下融合形成的。发表此结果的三个研究小组分别为：日本癌症研究会和自治医科大学小组、日本国立癌症研究中心小组、美国的研究所及名古屋市立大学小组。

有分析认为，肺腺癌占肺癌总数的约7成。各小组对患者组织进行调查时，在1~2%的患者体内发现了该融合基因。通过白鼠细胞等试验，各小组发现了这种融合基因具有诱发癌症的特性，并确认甲状腺癌等的治疗药等可杀死由此产生的癌变细胞。像这种新的融合基因表达引起的疾病会给我们在将来的疾病治疗中带来新的视角。

研究进展

在芯片方向主要代表为Affymetrix ,Aglient, illumina等公司。在2011年底Affymetrix推出了Glue Grant Human Transcriptome Array，这种芯片将复杂的转录组信息合成在一张芯片上，能对mRNA，lncRNA，microRNA进行差异筛选，并且还能检测他们之中的SNP位点，可谓是芯片技术的一大革新。

在测序方向需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。

前不久刚刚结束的Science杂志年度十大科学突破评选中，外显子组测序名列其中。

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