巢式PCR

变异的聚合酶链反应CR

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

巢式PCR的定义

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通 PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片段，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

巢式PCR反应

巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物扩增特异性的DNA片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。

巢式PCR的步骤

第一步：目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段（图中未显示可能的多种产物）。

第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

应用

一般应用于动物方面。如：病毒，梅毒螺旋体，HIV，肿瘤基因等。

在RACE(rapid-amplification of cDNA ends)中，也利用巢式PCR增加特异性。

在Illumina公司平台的第二代高通量测序中，也应用类似巢式PCR的原理，进行目的片段的扩增。

如图，首先在目的片段通过TA克隆，引入一个片段，然后在特定的一个Flow Cell固定大量的特异探针，通过PCR反应的特异性，扩增目的片段，然后继续应用于下一步测序

巢式PCR，可以在10的六次方基因组背景下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次PCR容易产生成片的产物，是效果最好的PCR，扩增质量最高的PCR。使用两套引物扩增特异性的DNA片段。第二对引物的功能是特异性的扩增位于首轮PCR产物内的一段DNA片段。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。从而提高反应的特异性。

右图为巢式PCR反应模式图：

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