最小抑菌浓度

用试管稀释法测定细菌对药物的敏感性

最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration）指用试管稀释法测定细菌对药物的敏感性。完全抑制细菌生长的最高稀释管1毫升所含的药量。亦即被测细菌对该药的敏感度。因药物和细菌的种类不同，需具体规定药物的稀释范围使用培养基的种类、加菌量，培养条件和判定结果的时间。

浓度测定

实验目的

（1）掌握细菌培养技术，包括细菌的分离、培养，含菌量的测定。

（2）掌握细菌分离培养过程中的无菌操作。

（3）掌握微量肉汤二倍稀释法测定抗菌药物MIC的基本步骤。能准确测出各种抗菌药物的MIC值，了解单药的抗菌活性。

（4）为棋盘法设计棋盘做准备，求取棋盘法的中心浓度。

实验原理

抗生素在体外体系内能够对细菌的生长起到一定的抑制生长的作用。

实验准备

1、菌株：标准菌株或临床分离菌株。

2、药物及培养基：两种抗菌药（注明来源及含量）、MH肉汤培养基和LB营养琼脂等。

3、器材：96孔细胞培养板、1ml和200μL移液枪、1ml和200μL枪头、10ml刻度吸管、洗耳球、小试管、锥形瓶、容量瓶、小药瓶加塞、试管架、平皿、接种棒、酒精灯、分析天平、自动高压灭菌锅、超净工作台和37℃恒温箱等。

方法与步骤

1、实验前的准备

（1）器具的清洗：将试管、平皿、锥形瓶、枪头等实验器具洗净、包好，121℃、20min高压灭菌，放烘箱烘干备用。

96孔细胞培养板（不可高压灭菌）用洗液浸泡、超声、冲洗干净后，泡75%酒精备用（用前取出放超净台吹干，紫外杀菌2h以上）。

（2）试剂的配制：

①磷酸缓冲液（PBS）的配制：见图1。

②生理盐水的配制：称取0.9g NaCI于锥形瓶中，加入100ml蒸馏水，溶解。

③MH琼脂、肉汤的配制：按照实际说明书的要求，称取一定量LB琼脂于锥形瓶中，加入100ml蒸馏水，溶解。按照试剂说明书的要求，称取一定量MH肉汤粉于锥形瓶中，加入100ml蒸馏水，溶解。取琼脂和肉汤分装于小试管中，每管2ml。

将配好的琼脂、肉汤包装好，121℃、20min高压灭菌。待琼脂稍冷后，在超净台倒平板（15～20ml琼脂平板），凝固后置37℃恒温培养箱过夜做无菌检查，合格后和肉汤一起置于4℃冰箱保存备用。

（3）药物原液的配置及保存：各种抗菌药用蒸馏水或不同pH的PBS稀释至所需浓度，抗生素过滤除菌，化学合成药高压灭菌。分装备用（图2）。

（4）菌液的配制：挑取标准菌株或临床分离菌株，放入MH营养肉汤，37℃培养16～24h，第二天在LB营养琼脂平板上划线培养16～24h，第三天挑单个菌落接种于2ml MH营养肉汤中，温箱培养16～24h，制得供试菌液。

细菌含量测定

（1）用生理盐水将上述菌液做10倍梯度稀释（0.5ml菌液+4.5ml生理盐水）。

（2）取10-5、10-6、10-7三个滴度的菌液各0.1ml滴在琼脂平板中央，轻轻拍打，使其均匀摊开，不要接触平皿边缘，每个梯度做2个平板，放入37℃温箱培养16～24h。

（3）计算菌落数：挑选长有30～300个菌落的平板来计数。两个平板的计数结果取其平均值为细菌浓度，要求生长浊度达9×108个/ml。计算示例：10-6两个平板上生长菌落数分别为68、70个，平均69个/0.1ml，则1ml含活菌落数690×106个/ml，即生长浊度为6.9×108个/ml。

（4）将供试菌液（3步制得）用肉汤做1：10000稀释（最终的浊度为10。）。

抑菌浓度测定

（1）在96孔培养板的前3排（即A、B、C 3排）每孔中各加入含TTC（5%）的空白肉汤100μL。

（2）在A、B、C 3排的第1孔加配好的药液（浓度为512IU/ml或μg/ml）100μL，然后对药物进行二倍稀释，即第1孔中加入药液后用移液枪充分吹打（至少3次以上）使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μL加入第2孔，再充分吹打使之与肉汤充分混匀，同样吸取100/μL加入第3孔中，照此重复直至最后一孔，吸取100μL弃去；此时每孔药物浓度从左到右依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 IU/ml（或ug/ml）。

（3）再在每一孔中加入稀释好的菌液100μL，这样就形成测定一个药物MIC值的3次重复（A、B、C 3排样品）。此时每孔药物浓度即最终药物浓度，从左到右依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0、0.5、0.25、0.125、0.06 IU/ml（或μg/ml）。

（4）另外在同一块板上做一排阴性对照（仅加空白肉汤不加菌液）和一排阳性对照（加菌液肉汤不加药液）。

（5）将96孔培养板放入37℃恒温培养箱培养16～20h后，观察结果。

实验结果与分析

将实验结果填入图3和图4，并分析原因。

两种菌介绍

最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration）常分别缩写为MIC或MBC，单位以μg/ml或mg/L来表示，为最小抑制病原微生物繁殖或杀灭病原微生物生存的药物浓度，用于衡量抗感染药（包括抗生素、抗菌药、化学合成药）抵抗病原微生物的能力。

使用抗感染药治疗的最终目的是根除人体被感染部位的病原微生物，从微生物学角度看是通过达到和维持一定的抗感染药的浓度来实现的，抗感染药在体内或体外的浓度要达到或超过MIC，才能抑制病原微生物的生长；浓度要达到或超过MBC，才能杀灭病原微生物。当然，其浓度数值越小，其抗病原微生物的活性越强。

与此相对应的有MIC50或MIC90、MBC50或MBC90，分别为抑制50%或90%病原微生物繁殖或杀灭50%或90%病原微生物生存的最小浓度。

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