核糖体展示技术

由Plückthun 实验室改进的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术

核糖体展示技术(Ribosome Display Technology, RDT)是由Plückthun 实验室在多聚核糖体展示技术的基础上改进而来的一种利用功能性蛋白相互作用进行筛选的新技术，它将正确折叠的蛋白及其 mRNA同时结合在核糖体上，形成mRNA-核糖体-蛋白质三聚体，使目的蛋白的基因型和表型联系起来，可用于抗体及蛋白质文库选择、蛋白质体外改造等。运用此技术已成功筛选到一些与靶分子特异结合的高亲和力蛋白质，包括抗体、多肽、酶等，是蛋白质筛选的重要工具。

原理

核糖体展示技术通过聚合酶链反应（PCR）扩增DNA文库，同时引入T7 启动子、核糖体结合位点及茎-环结构，将其转录成 mRNA，在无细胞翻译系统中进行翻译，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成 “mRNA-核糖体-蛋白质” 复合物，构成核糖体展示的蛋白文库，然后用相应的抗原从翻译混合物中进行筛选，以乙二胺四乙酸（EDTA）解离结合的核糖体复合物或以特异抗原洗脱整个复合物，并从中分离mRNA。通过反转录聚合酶链反应（RT- PCR）提供下一轮展示的模板，所得 DNA进入下一轮富集，部分 DNA可通过克隆进行测序分析等。

Kawasaki 曾建议采用类似的途径从肽库中筛选多肽配体。在此之前，利用前期多肽抗体进行免疫沉淀，已经分离到了与核糖体和多肽偶联的mRNA。 Mattheakis等人首次将前人的设想付诸实践，建立了筛选多肽类配体的多聚核糖体展示技术，并从一个库容为10^12的肽库中，筛选到亲和力常数达到10^9 (nmol级) 的固定化单抗的多肽配体。 Gersuk等人利用该技术也筛选到前列腺癌肿瘤标记的多肽配体。体外翻译时，蛋白或多肽的折叠与翻译同步进行u。与核糖体结合的天然多肽也具有酶活性。这些研究结果说明，如果某种蛋白质的折叠不受核糖体蛋白通道的影响，那么与核糖体的解离就不是该蛋白获得天然构像的必要条件。1 9 9 7 年，Plückthun实验室在以上研究成果的基础上，对 M a t t h e a k i s的多聚核糖体展示技术进行了改进，建立了体外筛选完整功能蛋白( 如抗体 ) 的新技术：核糖体展示技术。

操作步骤

基因片段的改造

为了使基因片段能有效转录和翻译,5′端应接上T7启动子序列和SD序列，去掉3′端的终止密码子,从而成功地使核糖体停留在mRNA3′末端,将蛋白质和mRNA连接在一起。在对基因片段改造时,常进行多次延伸PCR：

①分别将需要的基因片段和间隔序列各自扩出来

② 用引物 4 和引物 5 做连接 PCR 将目的基因和间隔子连接起来，引物5含有SD序列, 引物4含有3′端茎环结构序列。

③ PCR产物再进行延伸PCR,引物6含有T7启动子序列和5′端茎环结构序列,下游产物同前。最后得到的PCR产物,5′端接上T7启动子和茎环结构以及SD序列,3′端则融合了间隔序列并含有3′端的茎环结构

体外转录和翻译

（1）体外表达可以利用来自原核的E.coliS30无细胞蛋白质合成系统,或真核的兔网织红细胞裂解液和麦胚提取物的蛋白质合成系统,至于何种系统更适合,尚有争议.体外转录与体外翻译可以偶联进行,也可以分别进行.已有以DNA 为模板的体外蛋白翻译系统和以RNA为模板的体外转录与翻译偶联的商用系统问世。

对于含二硫桥的ScFv抗体和其他蛋白质,转录和翻译应分别进行,因为含有二硫桥的蛋白质要在氧化条件下才能正确折叠,但转录时,T7 RNA聚合酶要求具还原性的β-巯基乙醇维持其稳定性。如果目标蛋白在还原性条件下能正确折叠,则体外转录/翻译偶联体系效果可能更好.。

（2）若分别进行,则需要控制RNase的影响.VRC—过渡态类似物—作为RNase抑制剂,能有效抑制核酸酶,提高E.coli核糖体展示效率。翻译结束后立即冷却反应混合物,所有筛选步骤在冰上进行降低RNase的影响。另外,3′端和5′端的茎环结构也可以使mRNA避免核酸外切酶RNaseⅡ和核酸内切酶RNase E的影响。

亲和筛选

体外翻译反应结束后,将翻译混合物稀释4倍终止反应。反应试剂中始终保持5 mmol/L Mg2+浓度，稳定mRNA-核糖体-蛋白质三元复合体。可以直接用于筛选实验，也可以于4℃保存，核糖体复合物在4℃至少可以稳定10 d，但产量会逐渐减少。体外筛选时加入1%~2%脱脂奶粉和0.2%肝素可以降低抗原-抗体的非特异性反应,肝素还能抑制核酸酶。

①亲和筛选

分为固相筛选和液相筛选，主要有ELISA和磁珠法。Hanes等认为,ELISA方法中，抗原包被在塑料表面上，而塑料表面的疏水作用有可能会影响吸附蛋白的空间构象，从而导致筛选出的抗体分子不能识别抗原的天然表位;磁珠法是在抗原上连接捕获标签，如生物素，然后在形成抗原-抗体复合物后,采用磁珠-链霉亲和素捕获该标签,进行亲和筛选。

②mRNA的分离

筛选完后，加入含20 mmol/LEDTA的冰冷缓冲液洗脱mRNA。洗脱下来的mRNA用DNaseⅠ处理去除残留的DNA模板，进行RT-PCR反应重新引入T7启动子，SD序列等核糖体展示必需元件用于下一轮展示或直接进行Northern杂交，评价筛选效率。将最后一轮筛选到的靶标基因与质粒连接,转化到大肠杆菌中，可以得到单个靶标克隆。进一步采用体外或体内(分泌型或包涵体型)表达方式表达单链抗体分子,进行活性鉴定。

体外分子定向进化

用核糖体展示技术对未变异的文库进行筛选时,可以通过易错PCR或(DNA shuffering)等方法引入突变和重组技术,增加分子多样性,从而提高获得高亲和力、良好稳定性或增加酶活性靶标分子的机率.Plückthumx小组利用核糖体展示技术筛选到1.1 nmol高亲和力的ScFv,之后通过引入DNA重排技术,又将其亲和力提高。

优势

核糖体展示技术完全在体外进行,与噬菌体或酵母菌展示技术相比具有建库简单、库容量大、分子多样性强、筛选方法简便、无需选择压力,还可通过引入突变和重组技术来提高靶标蛋白的亲和力等优点,是一种筛选大型文库和获取分子进化强有力的方法。

问题

如何进一步地提高该系统的稳定性；特别是如何防止mRNA的降解和形成稳固的蛋白质-核糖体-mRNA三聚体无疑是该技术的关键问题；如何提高大分子蛋白质在核糖体上的展示也是未来研究需要关注的问题。

前景

随着对核糖体展示技术的进一步研究,以上问题将逐步得到解决,核糖体展示技术作为一种新兴的克隆展示技术,必将在蛋白质相互作用研究、新药开发以及蛋白组学等方面显示出更为广泛的应用空间.。

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