荧光分析法

化学术语

荧光分析法是指利用某些物质被紫外光照射后处于激发态，激发态分子经历一个碰撞及发射的去激发过程所发生的能反映出该物质特性的荧光，可以进行定性或定量分析的方法。由于有些物质本身不发射荧光（或荧光很弱），这就需要把不发射荧光的物质转化成能发射荧光的物质。例如用某些试剂（如荧光染料），使其与不发射荧光的物质生成络合物，各种络合物能发射荧光，再进行测定。因此荧光试剂的使用，对一些原来不发荧光的无机物质和有机物质进行荧光分析打开了大门，扩展了分析的范围。

基本信息

特点：灵敏度更高 g/ml，应用不如UV广泛。

应用：①直接荧光光度法

②作为HPLC的检测器（用的多）

根据物质分子吸收光谱和荧光光谱能级跃迁机理，具有吸收光子能力的物质在特定波长光（如紫外光）照射下可在瞬间发射出比激发光波长长的光，即荧光。

分子受特定光照射后处于激发态的分子返回基态时发出荧光，其荧光强度与呈线性关系，从而可测出气体浓度。当检测仪器系统确定后，荧光总光强I与浓度的之间的关系可表示为：

I=KC

在稳定的条件下，这些参数也随之确定，k可视为常数。因此，式中I=kC表示的紫外荧光光强I与样气的浓度C成线性关系。这是紫外荧光法进行定量检测的重要依据。

直接测定法

利用物质自身发射的荧光进行测定分析。

间接测定法

不管是直接测定，还是间接测定，一般的采用标准工作曲线法，取各种已知量的荧光物质，配成一系列的标准溶液，测定出这些标准溶液的荧光强度，然后给出荧光强度对标准溶液的浓度的工作曲线。在同样的仪器条件下，测定未知样品的荧光强度，然后从标准工作曲线上查出未知样品的浓度（即含量）。

一般常用的荧光分析仪器有：目测荧光仪（荧光分析灯）、荧光光度计和荧光分光光度计三种。

荧光的产生

根据波兹曼（Boltzmann）分布，分子在室温时基本上处于电子能级的基态。当吸收了紫外-可见光后，基态分子中的电子只能跃迁到激发单重态的各个不同振动-转动能级，根据自旋禁阻选律, 不能直接跃迁到激发三重态的各个振动-转动能级。

处于激发态的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁和无辐射跃迁等方式释放多余的能量而返回至基态，发射荧光是其中的一条途径。

振动弛豫（vibrational relexation）

是处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撺而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。由于能量不是以光辐射的形式放出，故振动弛豫属于无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级内进行，发生振动弛豫的时间约为秒数量级。

内部能量转换（internal conversion）

简称内转换，是当两个电子激发态之间的能量相差较小以致其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射方式转移至低电子能级的过程。

荧光发射

无论分子最初处于哪一个激发单重态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单重态的最低振动能级，然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态的任一振动能级上,这时发射的光量子称为荧光。由于振动弛豫和内转换损失了部分能量，故荧光的波长总比激发光波长要长。发射荧光的过程为秒。由于电子返回基态时可以停留在基态的任一振动能级上，因此得到的荧光谱线有时呈现几个非常靠近的峰。通过进一步振动弛豫，这些电子都很快地回到基态的最低振动能级。

外部能量转换（external conversion）

简称外转换，是溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能的形式释放能量的过程。外转换常发生在第一激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中。外转换会降低荧光强度。

体系间跨越（intersystem crossing）

是处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程。分子由激发单重态跨越到激发三重态后，荧光强度减弱甚至熄灭。含有重原子如碘、溴等的分子时，体系间跨越最为常见，原因是在高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。另外，在溶液中存在氧分子等顺磁性物质也容易发生体系间跨越，从而使荧光减弱。

磷光（phosphorescence）发射

经过体系间跨越的分子再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级，分子在激发三重态的最低振动能级可以存活一段时间，然后返回至基态的各个振动能级而发出光辐射，这种光辐射称为磷光。由于激发三重态的能级比激发单重态的最低振动能级能M低，所以磷光辐射的能量比荧光更小，亦即磷光的波长比荧光更长。因为分子在激发三重态的寿命较长，所以磷光发射比荧光更迟，需要秒或更长的时间。由于荧光物质分子与溶剂分子间相互碰撞等因素的影响，处于激发三重态的分子常常通过X辐射过程失活回到基态，因此在室温下很少呈现磷光，只有通过冷冻或固定化而减少外转换才能检测到磷光，所以磷光法不如荧光分析法普遍。

特点

荧光分析是一种先进的分析方法，它比电子探针法、质谱法、光谱法、极谱法等都应用的较广泛和普及，这同荧光分析具有很多优点分不开的。荧光分析所用的设备较简单，如目测荧光仪和荧光光度计构造非常简单完全可以自己制造。比起质谱仪、极谱仪和电子探针仪来它在造价上要便宜很多倍，而且荧光分析的最大特点是：分析灵敏度高、选择性强和使用简便。同时具备这三大特点的仪器并不多。

灵敏度高

荧光分析法的最大特点是灵敏度高，对某些物质的微量分析可以检测到克数量级，如污水中的银含量用荧光分析法可以检测到克，汞可以检测到克。对一些激素亦可检测到克。荧光分析的灵敏度比分光光度法的灵敏度高2~3个数量级，这是由于荧光分析的荧光和入射光之间成直角，而不在一条直线上，所以是在黑背景下检测荧光。而分光光度法的接收器与入射光在一条直线上，所以它是在亮背景下检测。因此荧光分析法比分光光谱法灵敏度高。分光光谱法的灵敏度一般只能检测到克，两者相差三个数量级。当然荧光分析法比起带电子显微镜的电子探针法灵敏度又低一些，然而电子探针仪器价格昂贵，使用不方便。

选择性强

荧光分析的第二个特点是选择性强，特别是对有机化合物而言。因荧光光谱既包括激发光谱又包括发射光谱，凡是能发射荧光的物质，必须首先吸收一定波长的紫外线，而吸收了紫外线后不一定就发射荧光。能发射荧光的物质，其荧光波长也不尽相同。如果即使荧光光谱相同的话，而它的激光光谱也不一定相同。反之如果它们的激发光谱相同，则可用发射光谱把它们区分开来，因此供选择的余地是比较多的。所以荧光分析的选择性很强。例如有两种物质，它们的荧光光谱很相似，不易把它们分开。但它们的激光光谱不会相同，因此就可用扫描激光光谱把它们分开。如果用分光光谱法就难以办到这一点，因为分光光谱只能得到待测物质的特征吸收光谱。所以分光光谱法的选择性就没有荧光分析法强。

用例

有机物质的荧光分析

有机化合物的荧光分析应用很广泛，能测定的有机物质有数百种之多，如酶和辅酶的荧光分析，农药和毒药的荧光分析，氨基酸和蛋白质的荧光分析，核酸的荧光分析。这些构成了荧光分析技术的主要内容。许多有机化合物在紫外线的照射下，所发荧光并不强或不发荧光，因此必须使用某些有机试剂，以便生成的产物在紫外线照射下能发射强的荧光。例如脂肪族有机化合物就是用间接方法测定的。

无机元素的荧光分析

在紫外线照射下能直接发射荧光的化学元素并不很多，所以对一些元素进行荧光分析时大部分采用间接测定法，这就是用有机试剂与被测定的元素组成络合物。这些络合物在紫外线照射下能发射出不同波长的荧光素，然后由荧光强度测定出该元素的含量。由于有机荧光试剂的品种繁多，用荧光分析可测定的元素有六十多种。

例如对铅的荧光分析：铅离子Pb与Cl离子组成铅氯络合物，该络合物在短波紫外光270毫微米激发下，它会发射出蓝色荧光，荧光峰值波长在480毫微米，根据荧光强度在标准工作曲线上测定出Pb的含量。该法能测定0.1~0.6微克铅/毫升。

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