蛋白定量

蛋白质定量

蛋白定量即蛋白质定量，蛋白质定量根据其目的可分为全蛋白质的“总定量法”和特定蛋白质的“个别定量法”。蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分。为验证细胞裂解是否成功，或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量；为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量；为了将纯化好的蛋白用生物素或者报告酶进行标记，同样需首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。

蛋白定量介绍

蛋白质的定量分析是生物化学和其他生命学科员常涉及的分析内容。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法带来了许多具体的困难。

现测定蛋白质含量方法有很多。

① 根据物理性质：紫外分光光度法

② 根据化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowry法）、BCA法、胶体金法。

③ 根据染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。

④ 根据其他性质：荧光法。

蛋白定量分析也就涉及到生产科研的多个领域及行业，也是生物学科、食品检验及掺假掺伪、临床检验、诊断疾病和质量检验中最常见的方法。

蛋白定量的测试方法有很多种，其中较为常见的有五种，分别是Bradford法、Bradford斑点试验、Coomassie 斑点试验、紫外分光度检测法及BCA法这五种。当然，每种方法适用的情况都有所不同。

Bradford法

该方法用于大多数蛋白质定量是相当精确的，特别是用于小分子多肽定量。如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污剂的浓度超过0.2%则影响定量结果。如TritonX-100，SDS，NP-40等。

Bradford斑点试验

该方法特别适用于检测洗脱组分，以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。

Coomassie 斑点试验

该方法特别适用于检测洗脱组分以定位蛋白洗脱液。例如检测洗脱液的吸附力的强弱。

紫外分光度检测法

蛋白质紫外光吸光率是所有的蛋白质定量方法中最快的方法。通常在280nm光波长下读数。其在280nm光波长下的最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在。在205nm光波长的吸收也常用到。其在205nm光波长下的最大吸光率主要处决于肽链，尽管氨基酸也有影响。另外，一个主要的优点是在测定蛋白质浓度时，样本不会遭到损害。

BCA法

BCA法特点： 1、灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。 2、测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。 3、在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。 4、检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5.、受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mm。

蛋白样本定量

蛋白测定试剂盒和比色皿：可允许通过修改 Bradford 和 Lowry 方法进行蛋白测量。

分光光度法：bio-rad SmartSpec Plus 是一种紫外/可见分光光度计，适用于多种定量应用。

荧光测定法：台式 VersaFluor 荧光计可容纳支持大范围激发和发射波长的过滤器。

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