ras基因

转化基因

ras基因首先在Harvery鼠肉瘤病毒（Ha-MSV）和Kirsten鼠肉瘤病毒（Ki-MSV）的子代基因中被发现，在这种子代病毒中发现含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序列，此后人们将这种宿主细胞基因称为ras基因。

基因发现

1982年Weinberg和Barbacid首先从人膀胱癌细胞系中分离出一种转化基因，可使NIH 3T3细胞发生恶性转化，而从正常人组织中提取的DNA则无此种作用。随后，Santos与Parada发现上述转化基因并非新型基因，而是Harvery鼠肉瘤病毒ras基因的人类同源基因，命名为H2ras。同年，Krontiris在人肺癌细胞中发现Kirsten鼠肉瘤病毒基因的同系物，称为K-ras.另一种相似的基因是在人神经母细胞瘤DNA感染NIH3T3细胞时发现的与ras类似的基因，称为N2ras，此种基因和病毒无关.

基因结构

ras基因在进化中相当保守，广泛存在于各种真核生物如哺乳类，果蝇，真菌，线虫及酵母中，提示它有重要的生理功能.哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是H-ras,K-ras,N-ras，其中K-ras的第四个外显子有A,B两种变异体.各种ras基因具有相似的结构，均由四个外显子组成，分布于全长约30kb的DNA上.它们的编码产物为相对分子质量2.1万的蛋白质，故称为P21蛋白.已证明，H-ras位于人类11号染色体短臂上（11p15.1～p15.3）,K-ras位于12号染色体短臂上（12p1.1～pter）,N-ras位于1号染色体短臂上（1p22-p32），除了K-ras第四个外显子有变异外，每个ras基因编码P21的序列都平均分配在四个外显子上，而内含子的序列及大小相差很大，因而整个基因也相差很大，如人K-ras有35kb长，而N-ras长为3kb.由于有两个第四号外显子，K-ras可以两种方式剪接，但编码K-ras-B的mRNA含量高.除K-ras-B含有188个氨基酸外，其他两种Ras蛋白均含有189个氨基酸.

Ras蛋白

3.1 Ras蛋白的结构

Ras蛋白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白，相对分子质量为2.1万，定位于细胞膜内侧.它由188或189个氨基酸组成，它的第一个结构域为含有85个氨基酸残基的高度保守序列，接下来含有80个氨基酸残基的结构域中，Ras蛋白结构轻微不同，除了K2Ras末端25个氨基酸由于不同的外显子而分为A型和B型外，其余Ras家族成员最后四个氨基酸均为Cys1862A2A2X2COOH序列.Ras蛋白存在4种异构型：H2Ras,N2Ras,K2Ras4A和K2Ras4B，它们是3种基因的产物，其中K2Ras4A和K2Ras4B是同一基因不同剪接的结果.

3.2 Ras蛋白的功能

Ras（P21）蛋白位于细胞膜内侧，它在传递细胞生长分化信号方面起重要作用.它属于三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白（一种细胞信息传递的耦联因子），通过GTP与二磷酸鸟苷（GDP）的相互转化来调节信息的传递.P21与GTP和GDP有很强的亲和性，而且有较弱的GTP酶活性.正常情况下P21和GDP结合处于失活状态，当细胞外的生长分化因子把信号传导到胞膜内侧的P21时，可增强P21与GTP结合活性，使P21和GTP结合成为激活状态，信号系统开放.因为P21有GTP酶活性，可使GTP水解成GDP,P21和GDP结合后P21失活，信号系统关闭.正常情况下P21的GTP酶活性很弱，当和GTP酶激活蛋白（GAP）结合后其水解速度可提高1万倍而使P21失活.P21和GDP结合后可以激活鸟苷酸释放蛋白（GNRP）,GNRP使P21释放GDP结合GTP，因此通过GTP和GDP的相互转化可以有节制地调节P21对信号系统的开启和关闭，完成生长分化信号传入细胞内的过程.

Ras蛋白在合成后，需要经过两种方式翻译后修饰，才可定位于细胞膜内侧.①通过FTase在Ras蛋白羧基端的CAAX四肽结构中的Cys残基上加上一个类异戊二烯基团法尼基，随后AAX残基从C端上断裂脱落，法尼基化Cys

羧甲基化，此修饰使RasC端具有疏水性；②N2或H2ras的半胱氨酸的S2酰基化，长链的S2酰基取代基使ras具有疏水性.有研究表明，激活ras的表达能增强血管生长因子（例如VEGF/VPF）的表达，提示Ras蛋白在血管生成中发挥作用，抑制Ras蛋白活性能抑制依赖Ras蛋白的肿瘤细胞增殖，也能干扰血管生成.同时，激活Ras蛋白还能抑制凋亡.Ras蛋白过度表达还能增加药物和紫外光诱导的凋亡，可能的机制是ras癌基因增强了细胞分解过氧化氢的能力从而抑制凋亡.然而，这个假说还需进一步研究.

基因活化机制

4.1 ras基因激活的方式

作为原癌基因的ras基因被激活以后就变成有致癌活性的癌基因.ras基因激活的方式有3种：基因点突变，基因大量表达，基因插入及转位.其中ras基因被激活最常见的方式就是点突变，多发生在N端第12,13和61密码子，其中又以第12密码子突变最常见，而且多为GGT突变成GTT.不同突变位点对P21的活化机制不同，第12密码子突变可以减弱P21内在的GTP酶活性，并使细胞凋亡减少，细胞间接触抑制减弱；第61密码子突变可削弱GAP对P21的内在GTP酶活性，并可减弱GAP与P21结合的稳定性.

4.2 ras基因突变致癌的机制

ras基因激活构成癌基因，其表达产物Ras蛋白发生构型改变，功能也随之改变，与GDP的结合能力减弱，和GTP结合后不需外界生长信号的刺激便自身活化.此时Ras蛋白内在的GTP酶活性降低，或影响了GTP的活性，使Ras蛋白和GTP解离减少，失去了GTP与GDP的有节制的调节，活化状态的Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使，造成细胞不可控制地增殖，恶变.同时细胞凋亡减少，细胞间接触抑制增强也加速了这一过程.

信号转导途径

Ras2MAPK信号转导途径

5.1 Ras上游通路

Ras能被复杂的网络激活.首先，被磷酸化激活的受体如PDGFR,EGFR直接结合生长因子受体结合蛋白（Grb2），这些受体也可以间接结合并磷酸化含有src同源区2（SH2）结构域的蛋白质（例如Shc,Syp）后，再激活Grb2.第二，Grb2的src同源区3（SH3）结构域与靶蛋白如mSos1,mSos2,C3G及发动蛋白（dynamin）结合.C3G与连接蛋白Crk的SH3结构域结合后耦联酪氨酸磷酸化而激活Ras.Crk也能结合mSos1激活Ras.Grb2与激活的受体结合促进鸟苷酸交换因子（Sos）蛋白定位在与Ras相邻的细胞膜上.这样，Sos与Ras形成复合体，GTP取代GDP与Ras结合后，Ras被激活，当GTP水解成GDP后Ras失活.Ras具有内在GTPase活性，它的活性可被RasGAPs调节，因而RasGAPs扮演Ras活性调节剂的角色.另外，Ras失活也受到高度调节。有三种蛋白质能水解GTP使Ras失活，它们分别是P120GAP,neurofibromin和GAP1m，统称为RasGAPs.

5.2 Ras下游通路

5.2.1 Ras/Raf通路

Ras/Raf通路是最明确的信号转导通路.当GTP取代GDP与Ras结合，Ras被激活后，再激活丝苏氨酸激酶级联放大效应，招集细胞浆内Raf1丝苏氨酸激酶至细胞膜上，Raf激酶磷酸化MAPK激（MAPKK）,MAPKK激活MAPK.MAPK被激活后，转至细胞核内，直接激活转录因子.另外，MAPK刺激Fos,Jun转录因子形成转录因子AP1，该因子与myc基因旁的特异的DNA序列结合，从而启动转录.myc基因产物也是转录因子，它能激活其他基因.最终，这些信号集中起来诱导D型Cyclin的表达和活性.D型Cyclin与Cyclin依赖性激酶（如CDK4和CDK6）形成复合体，该复合体的形成促使细胞从G1期进入S期.因此，Ras/Raf通路在受体信号和G1期进展之间起着关键作用.然而，Ras/Raf通路不是调控G1期进展的惟一通路.Ras与Raf单独结合不能促进Raf激酶活性，同时，Raf能被不依赖Ras的机制所激活（例如能被Src酪氨酸激酶和PKC所激活），MAPK也能被不依赖Ras机制（如通过调节整合素的活性）所激活.表明级联反应每一个信号蛋白质都能被多个上游蛋白质所激活，而它们也可能有另外的靶蛋白.另一个重要的Ras通路效应物是Cyc2lin依赖性激酶抑制剂P21Waf1/cip1，它被Ras所诱导，抑制Cdk2CyclinE和Cdk2CyclinA复合体的活性，从而阻断DNA的合成.

5.2.2 Rho/Rac通路

Rho家族蛋白质是小G蛋白的Ras超家族成员，其氨基酸序列大约有30%与Ras蛋白相同，三个主要的Rho蛋白是Cdc42,Rho,Rac.Cdc42刺激Rac,Rac接下来刺激Rho.然而，这个直线模型对于精确的信号转导通路来说过于简单，因为有证据显示交叉联系存在，例如Cdc42不通过Rac能影响Rho的活性.下游靶点Rho激酶α的激活，导致肌动蛋白的重新构建和P21激活的丝苏氨基酸激酶参与应力纤维的分解.最后Rac和Cdc42利用MAPK传递信号至核内，Rho通过刺激Src和fos启动子达到转录调节的作用.另外，Rac和Cdc42激活JunN端激酶，该酶结合Jun,EIk1和ATF2等转录因子，这就是Rho在细胞癌变过程中起重要作用的可能机制.另一个重要Rho下游靶点是P21Waf1/cip1.Rho抑制P21Waf1/cip1诱导，有利于Ras驱动细胞进入S期,P21Waf1/cip1阴性细胞不需要Rho进行Ras激活的DNA合成，降低了通过诱导P21Waf1/cip1在Ras转化过程中的重要性.

5.3 Ras2MAPK信号途径与肿瘤的关系

肿瘤发生与调控细胞增殖的信号发生异常有关.一些肿瘤病人生长因子或其受体的表达或功能出现异常，如卵巢癌病人血清中EGF和胰岛素样生长因子含量升高；EGF增高影响细胞间连接，促进细胞转移和浸润.临床资料表明，酪氨酸蛋白激酶受体过表达与肿瘤相关，ErbB22在乳癌病人中30%过表达；起源于上皮的肺癌，乳癌等EGFR过表达，并与高转移率，低生存率以及差的预后相关，通过降低EGFR表达可抑制EGFR过表达的卵巢癌细胞的增殖.肿瘤细胞ras基因突变率大约为25%，而胰腺癌和结肠癌分别达到85%和40%.ras癌基因主要以点突变和基因扩增方式存在，突变位点在第11,12,13,18,59,61密码子，是Ras蛋白和GAP的作用位点，由于突变，抑制了Ras内在的GTP酶活性，突变的Ras锁定在持续激活的Ras2GTP状态，引起细胞的恶性转化.raf癌基因与人类肿瘤关系密切，很少突变，但Raf持续活化，可导致细胞恶性转化；在小细胞肺癌病人的组织标本中，Raf在mRNA和蛋白水平均过表达，活性增高.在肿瘤治疗的研究中，可从以下几方面阻断Ras2MAPK信号转导途径：①酪氨酸蛋白激酶抑制剂，如Radici2col抑制V2Ha2ras转化的NIH3T3细胞的MAPK活性，使细胞表型逆转；新研究的酪氨酸蛋白激酶抑制剂能双重作用ErbB22和EGFR，广泛抑制ErbB22或（和）EGFR过表达的肿瘤生长.②抑制Ras法尼基化：法尼基转移酶抑制剂（FTIs）是分子水平抗癌药，抑制ras翻译后修饰，已有多种FTIs用于动物模型和临床前期实验，有明显的抗肿瘤作用，如SCH66336对表达高水平H2Ras2GTP和ras是否突变的肿瘤都有生长抑制作用，已进入临床试验.③反义核苷酸技术：C2H2ras反义RNA质粒降低人胃癌BGC2823细胞的H2ras表达并抑制细胞生长和部分恶性表型逆转；Raf21反义DNA抑制人白血病细胞的增殖.④其他：针对受体酪氨酸激酶与底物作用的SH2区或SH3区设计多肽，在体外实验抑制酶和底物结合.

临床应用

6.1 诊断

ras癌基因和P21在许多癌前病变中都有表达.Ochi等发现1例胰液中K2ras突变阳性而细胞学及影像学检查均阴性的病例，随诊18个月后才发现恶性细胞及影像学的变化.提示ras基因突变早于病理检出及临床表现的出现.提示可用检测ras癌基因或P21的方法对癌变倾向提供较早信息.Kimura等检测切除的胰腺标本中K2ras的突变率，在胰导管癌，胰黏液细胞癌和慢性胰腺炎中分别是81%,53%和7%，相应胰液中的突变率分别为72%,53%和0，所以检测胰液中突变的K2ras基因即可为临床诊断提供有力的帮助.Futakawa等检测52例胰腺癌病人胰液中突变的K2ras基因和癌胚抗原水平，结果显示这两项指标联合检测在胰腺癌诊断中的准确度是90%，因此可用联合检测的方法及早而准确地诊断肿瘤.

6.2 病情评估及预后判断

Shirakawa等通过检测P21,P53,Ki67和细胞角蛋白10发现食管鳞癌的分化程度取决于发育不良的程度，而P21在这个演化过程中起关键作用.Rak等发现突变的ras基因可强效刺激血管内皮细胞生长因子的表达.Thebo等对有K2ras12或13密码子突变的DukesB2期结直肠癌进行分析显示，80%的原发灶和局域淋巴结发生相同位点的ras基因突变，说明ras基因突变对肿瘤淋巴结转移是高风险因素.有文献报道，唾液腺癌中H2ras基因突变率与临床病理指标呈高度正相关，可通过检测基因突变来推测肿瘤所处的阶段和分化程度.可见检测突变的ras基因可为临床病情的评估提供有力的依据.

Harada等研究表明，P21（-）者5年生存率为64.1%,（+）者为38.0%，⑹者为11.5%,P21是决定生存率的重要而独立的指标.但许多文献报道ras基因突变和临床病理指标及预后没有明显的关系.联合检测非小细胞肺癌组织中K2ras,p53和cerbB2基因的异常表达，比单项检测可明显地提高对预后的评估，因此，可用联合检测对某种肿瘤较敏感的几个癌基因的方法来对预后进行评估.

6.3 治疗

研究表明，体外给予结肠癌细胞（HCT116/P21+/+）P21反义寡脱氧核苷酸，可提高癌细胞对放疗的敏感性；用末端含CAAX碱基的制剂作用于人类ras癌基因转染的动物细胞，可抑制癌细胞的生长；用核糖酶（K2rasR2）拮抗突变的K2ras12细胞系，可使细胞生长停止，凋亡增加，VEGF基因表达受抑.可见用分子生物学的方法治疗肿瘤是有广阔应用前景的.

总之，虽然对ras基因，Ras蛋白及Ras信号转导通路的研究已达一定的深度，ras基因已在临床有一些应用，但仍有许多问题需解决，如ras基因突变发生在肿瘤形成的哪些阶段，Ras信号转导通路与其他信号转导通路相互影响，相互交叉，阻断单一信号转导通路能否真正起到改变或影响肿瘤发生发展的作用等.随着对这些问题的研究，解决，人们将对肿瘤的预防，诊断和治疗提供更新更有效的方法.

Ras癌基因参与人类肿瘤的发生发展，最初是在急性转化性逆转录病毒实验中从Harvey、Kirsten两株大鼠肉瘤病毒中克隆出来的转化基因，自1982年Weinberg等人发现人的膀胱癌细胞中有活化的H-ras基因后，引起了人们对ras癌基因在人类肿瘤发生发展过程中所起的作用的极大关注。

ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——H-ras、K-ras和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。其中，K-Ras则对人类癌症影响最大，它好像分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。

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