印迹杂交

基因诊断技术

在基因操作中，把DNA或RNA、蛋白质等在薄膜滤器上先经浸润，固定后，于薄膜滤器上进行杂交，生成杂种分子。为基因操作中最常用的技术。

分析方法

印迹杂交

印迹杂交，是基因诊断技术的一种，有多种方式，第一种是Northern印迹杂交，是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。第二种是Southern印迹杂交，是由凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段。第三种是Western印迹杂交，是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。

分析对象

Northern杂交用于分析RNA；Southern杂交用于分析DNA；

Western杂交用于分析蛋白质。

大致过程如下：

(1) 酶切DNA，凝胶电泳分离各酶切片段，然后使DNA原位变性。

(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。

(3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点。

(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。

(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。

方式简介

Northern杂交

主要用于分析RNA，包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。

正向Northern杂交是将待测RNA固定在纤维膜上，用特异序列DNA探针与其杂交，再显影观察。

反向Northern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上，用待测RNA做成探针与其杂交，再显影观察。

Southern杂交

主要用于分析DNA，也包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。

正向Southern杂交是将待测DNA固定在纤维膜上，用特异序列DNA探针与其杂交，再显影观察。

反向Southern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上，用待测DNA做成探针与其杂交，再显影观察。

Western杂交

主要用于分析蛋白质，利用了抗原抗体特异性结合的原理。分为抗原法、夹心法、竞争法。

抗原法是将待测抗原固定在膜上，加特异抗体与其结合、洗膜、显色、观察。

夹心法是将一抗固定在膜上，加待测抗原、洗膜、加特异二抗、洗膜、显色、观察。

竞争法是分对照和试验两组，对照组将特异抗原固定在膜上，实验组将待测抗原固定在膜上，都加入特异抗体，显色、观察。用于比较抗原的特异性。

Northern印迹杂交

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。

Northern印迹杂交由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基因中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。

Southern印迹杂交

Southern印迹杂交（Southern blot）1975年由英国southern创建。

英文解释：use a DNA or a RNA probe to hybridize with DNA from a genome to detect whether there is/are the homologue DNA.

Southern印迹杂交是由凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。

Western印迹杂交

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

方法介绍

综述

Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照像，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。

试剂

10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L EDTA pH8.0。

5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝。

甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。

20×SSC；

去离子甲酰胺；

50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl)；

0.1mol/L Tris，pH7.5。

步骤

[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液，11.5ml 甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。

[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。

[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。

[4]55℃加热15min，冰浴冷却。

[5]加2ml5×载样缓冲液。

[6]上样、同时加RNA标记物。

[7]60伏电泳过夜。

[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。

[9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。

[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。

[11]20×SSC洗胶1小时。

[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。

[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2小时。

制备

预备

1．按下述步骤，每泳道加10～20μg总RNA或0.5～1μg poly(A)+RNA进行甲醛/琼脂糖凝胶电泳，将凝胶放在紫外线透照仪上，旁边置一标尺进行拍照。

a. 总RNA（10～20μg）用下列溶液在65℃温育5min：

总RNA（10～20μg） 6.0μl

甲酰胺 12.5μl

10×MOPS缓冲液 2.5μl

甲醛溶液（37%） 4.0μl

b. 置冰浴迅速冷却，加2.5μl上样缓冲液，并加样于按如下配制的甲醛/琼脂糖凝胶中。

琼脂糖 1.0g

10×MOPS缓冲液 10.0ml

H2O 73.0ml

c. 加热至100℃溶解凝胶，然后置50℃水浴箱降温。加17ml甲醛，混匀并立即倒胶。须在通风橱内带手套操作，用一电泳槽专供RNA电泳。

印迹

1、当凝胶仍在电泳时，裁一张与凝胶大小相同的滤纸，以20×SSC浸泡。

2、安装转移装置，盘内倒入杂交缓冲液（20×SSC）。在缓冲液平面上做一平台，将凝胶盘倒置，并盖三张经20×SSC饱和的滤纸（Whatman 3MM），平台两端的滤纸应浸入缓冲液中，用10ml的玻璃吸管滚动以赶除气泡并将滤纸推平。

3、在滤纸表面倒入数ml 20×SSC，将凝胶倒扣于滤纸上，小心赶除凝胶与滤纸间的气泡，凝胶四周用胶布粘贴或用塑料薄膜包裹以防缓冲液直接从凝胶周围流至纸中（虹吸短路）。

4、用数ml 20×SSC浸没凝胶，置滤膜于凝胶上，确保凝胶与滤膜之间无气泡。用软铅笔标记面对凝胶的滤膜面。

5、滤膜表面放三张大小与滤膜相似并预先用20×SSC浸泡的3MM滤纸。

6、放一叠干燥吸水纸（印迹纸或纸巾）在3MM滤纸表面（约5～8cm高）。

7、在折叠纸上放一玻璃板，并在玻璃板上置0.75～1kg重的物体。

8、转移进行12～16小时，确保槽内有足够的20×SSC（约3L）。

9、转印后，小心拆卸印迹装置，将凝胶与滤膜一起转移到干燥滤纸上，凝胶在上。用软铅笔标记凝胶和滤膜加样孔的位置，撕去凝胶。

10、以20×SSC漂洗滤膜片刻以去除琼脂糖残迹。

11、将滤膜放在一块干燥的3MM滤纸上稍微晾干。

12、固定RNA于滤膜上，将尼龙膜RNA面朝下在紫外透照仪照射3～5min。

13、此滤膜可用于杂交或4℃保存，尼龙膜需要塑料袋密封。

简介

1、用5×SSPE浸湿RNA滤膜。

2、将浸湿的RNA滤膜转移至塑料袋中，塑料袋四周封口并剪去一角。

3、预热预杂交液至42℃，经塑料袋开口处加入0.1ml/cm2的预热的预杂交液，小心移取，避免加入气泡，从塑料袋中挤压出所有气泡，密封塑料袋。

4、在42℃水浴摇床中温育塑料袋2～4小时，或将塑料袋夹于两块玻璃板中置42℃烤箱2～4h，确保滤膜表面无气泡。

5、置95℃ 10min使探针变性，立即置冰浴冷却5min。

6、剪去杂交袋一角，将预杂交液倒入15或50ml的Falcon试管中，加入约10～20ng/ml（随机引物标记）探针，一般来说，106～107cpm/ml已足够，轻轻混匀。用一次性塑料移液管将杂交液加入装有滤膜的塑料袋中。

7、从塑料袋的开口处将气泡全部压出，用纸巾揩去流出的少许杂交液，小心封好袋口，避免液体漏出。必要的话，可将塑料袋套入另一个塑料袋内以防放射性污染。

8、在42℃水浴摇床中温育12～16h，或夹在两块玻璃板中置42℃烤箱温育12～16h。

9、杂交完毕，打开塑料袋的一角，将杂交液倒入15或50ml的Falcon试管中。小心不要使放射性溶液溅出。

10、将塑料袋完全打开，用钝头镊子将滤膜转移至盘中以便清洗，立即用缓冲液（2×SSC，0.1%SDS）1漂洗滤膜。

11、室温下，用漂洗缓冲液1漂洗三次，每次5min。

12、室温下，用漂洗缓冲液2（0.25×SSC，0.1%SDS）漂洗两次，每次5min。

13、用预热45℃的漂洗缓冲液2漂洗1～3次，每次15min。在更换缓冲液之间，应用盖革计数器检测滞留在印迹中心的放射性。

14、充分漂洗后，把杂交膜放在一张3MM滤纸上稍晾干后，将潮湿的滤膜封在塑料袋内或用塑料薄膜包裹。

15、滤膜放射自显影：将杂交膜（包裹在塑料袋内，RNA面朝上）放在X射线暗盒底部，胶片放在其上。为方便起见，可将增感屏固定在暗盒盖上，关闭暗盒，在－70℃曝光1天～2周。

16、将暗盒从冰箱内移出时，应有足够的时间（30min～1h）使其温度调至平衡。在暗室将胶片从暗盒取出，并在自动X线底片处理仪上冲洗。

除去探针

1．煮沸0.1%SDS溶液。

2．把膜放在玻璃盘内，将溶液倒在膜上，凉至室温。

3．用盖革计数器检测降低的活性。

印迹杂交方法

综述

Southern印迹杂交（Southern blot）是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris 缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

琼脂糖凝胶电泳

利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消解片段（0.3～25kb）分离开，分离大分子DNA片段（800-12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%），分离小分子片段（500～1000bp）用高浓度琼脂糖（1.0%），300-5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶。根据分离样品品质，分离速度和分辨率要求的不同，可选用不同规格的电泳槽。电泳时，同时将分子量标记物加到旁边孔中，便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜，电泳完毕，将胶浸到含0.5μg/ml EB的TBE缓冲液中染色30min，也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中，在254nm短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈f4.5，曝光20-40秒。

硝酸纤维素膜吸印

[1]将胶片切成合适大小，切去右上角作为记号。

[2]将胶片放进盛有变性缓冲液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）的盘中轻晃15分钟。

[3]换到中和缓冲液（1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盘中轻晃30分钟。

[4]裁一张硝酸纤维素膜、2-4张3mm滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入10×SSC缓冲液，接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。

[5]平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张3mm滤纸，起灯蕊作用，盘中加入少量10×SSC缓冲液（2.5cm厚），不能没过平板，使3mm滤纸充分饱和。

[6]将胶倒扣在3mm滤纸上。

[7]浸湿的硝酸纤维素膜在胶上，对齐。铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。

[8]膜上放一张3mm滤纸，不能与胶接触。

[9]上面加吸印纸及重物（500g左右）。

[10]通过滤纸的灯芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸印到膜上，及时更换浸湿的吸印纸，在室温下转印过夜。

[11]清除上面的东西。用镊子将膜取出，在6×SSC中洗一下。