发光细菌

进行生物发光的细菌

发光细菌（luminescent bacteria.luminousbacteria），进行生物发光的细菌。多数为海生，与发光浮游生物同是引起海面发光的原因。此外，在空气中，死鱼及水产加工食品的表面于暗处也会发光，这种发光现象是海生菌第二次生长繁殖的结果。用加有3%NaCl，1%甘油的普通肉汁蛋白胨培养基可以培养。

发光细菌介绍

发光细菌 luminescent bacteria.luminousbacteria，进行生物发光的细菌。多数为海生，与发光浮游生物同能引起海面发光。此外，在空气中，死鱼及水产加工食品的表面于暗处也会发光，这种发光现象导致海生菌的第二次生长繁殖。用加有3%NaCl，1%甘油的普通肉汁蛋白胨培养基可以培养。发光菌形态虽多种多样，但生理特性却非常相似。一般对明胶不产生液化，分解蛋白质后不形成毒物，常寄生在各种动物体上引起“发光病”，即寄生发光。这些细菌通常经由寄主的卵传递给后代寄主。有些发光鱼类和乌贼是和发光细菌共生而利用了细菌的发光。明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）可在牛马的死尸和肉中繁殖；它侵入人体则会产生发光尿。这些细菌一般好低温，最适温度约为18℃，37℃以上则不发光。发光现象是酶促氧化反应，必需FM－NH2，O2 长链饱和醛，虫荧光素酶等。一般认为FMNH2就是荧光素。发光细菌有一百几十种，除上述几种外，典型的还有鱼无色杆菌（Achromobac-ter fisheri）、磷光弧菌（Vibrio phosphoresce－ns）、发光杆菌（Bacillus photogenus）等。细菌发光的生物学意义与动物发光不同，还不十分清楚。根据具有可以抑制氯高铁血红素呼吸浓度的一氧化碳或氰化物，而不能抑制其氧化过程这点来看，可以把它看作是不参与细胞色素系统的呼吸形式称为发光呼吸。发光细菌发出青白色光，如鱼无色杆菌所发出的光，最大波长为490纳米。

目前国内常用的3种发光细菌为：明亮发光杆菌、费氏弧菌、青海弧菌。

其中以明亮发光杆菌在 GB/T15441-1995 水质急性毒性的测定发光细菌法中所使用；

费氏弧菌在欧盟的标准中所使用；青海弧菌是在青海湖的鱼体内提取的菌种，属淡水菌，在测试饮用水时有较大优势，并已申请冻干粉制作专利：ZL 97106203.X

该检测方法在5.12汶川地震灾区有了较大规模的应用，快速、便捷、综合评价等优点得到了充分发挥，受到了卫生、环保、疾控部门的重视，国家也将其列入应急监测项目。能够提供此类设备的公司有北京滨松光子技术股份有限公司（国产技术）、荷兰microLAN公司、美国SDI公司、以色列checklight公司等，详细信息在其各自网站会有公布。

《发光细菌与环境毒性检测》一书由朱文杰、郑天凌、李伟民三位老师完成的作品，内容主要介绍了发光细菌的发现及应用领域等信息，着重介绍了青海弧菌的发展过程，大家感兴趣的话可以进行查阅！

分类

发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490nm之间，在黑暗处肉眼可见。全世界已命名的发光细菌有以下几种：① 属于异短杆菌属（Xenorhabdus）的有发光异短杆菌（Xenorhabdus luminescens）；② 属于发光杆菌属（Photobacterium）的有明亮发光杆菌（Photosbacterium phosphoreum）和鳆发光杆菌（P．1eiognathi）；③ 属于希瓦氏菌属（Shewanella）的有羽田希瓦氏菌（Shezoanella hanedai），以前也曾经把它归类为交替单胞菌属（Alteromonas）的海氏交替单胞菌（Alteromonas hanedia）；④ 属于弧菌属（Vibrio）的有哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、美丽弧菌生物型I（V．splendidus biotype I）、费氏弧菌（V．fischeri）、火神弧菌（V．1ogei）和东方弧菌（V．orientalis）。霍乱弧菌（V．cholerae）和地中海弧菌（V．mediterranei）中的某些菌株有发光现象，曾有报道易北河弧菌（V．albensis）有发光现象，后将其重新分类归入霍乱弧菌（V．cholerae）。另外，中国学者分离到一株淡水发光细菌命名为青海弧菌（V. qinhaiensis），还没收入伯杰氏细菌手册。

在以上发光细菌中，异短杆菌和青海弧菌属于淡水发光细菌，其它都是海洋细菌。发光细菌主要分布于海洋环境中。

发光机理

发光机理的研究表明，不同种类的发光细菌的发光机理是相同的，是由特异性的荧光酶（LE）、还原性的黄素（FMNH2）、八碳以上长链脂肪醛（RCHO）、氧分子（O2）所参与的复杂反应，大致历程如下：

FM NH2+LE → FMNH2·LE+ O2 → LE·FM NH2·O2

+ RCH O →LE·FMNH2·O2·RCH0 → LE+ FM N +H2O+RCOOH+光

概括的说就是，细菌生物发光反应是由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸（FMNH2）及长链脂肪醛氧化为FMN 及长链脂肪酸氧化，同时释放出最大发光强度在波长为450-490nm处的蓝绿光。其中三步反应产生三种中间产物，寿命极短，很难分离出来。

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，细菌荧光素酶是含α、β两个多肽亚基的单加氧酶，只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的细菌荧光素酶其分子量差别较小。王安平等分离纯化了东方弧菌的荧光酶并对其酶学性质进行了研究，分离得到了两个分子量分别为44 kD和41 kD的亚基，该酶反应的最佳温度在l8℃ ，超过25℃酶即迅速失活。

应用分类

环境监测

发光细菌由于其独特的生理特性，在环境监测中被作为测定环境中毒物的指标。发光细菌在正常的生理条件下能发出波长在450～490nm 的蓝绿色可见光，在一定的试验条件下发光强度是恒定的。与外来受试物接触后，由于毒物具有抑制发光的作用，发光细菌的发光强度即有所改变，变化的程度与受试物的浓度在一定范围内呈相关关系，同时与该物质的毒性大小有关。外来受试物主要通过下面两个途径抑制细菌发光：① 直接抑制参与发光反应的酶类活性；②抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程。凡能够干扰或破坏发光细菌呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测定。利用发光细菌来检测有毒物质，由于有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统，发光强度的变化可以用发光光度计测出，费时较少且灵敏度高，操作简便，结果准确，所以利用发光细菌的发光强度作为指标来监测有毒物质，在国内外越来越受到重视，在环境监测中的应用也越来越广泛。

利用发光细菌毒性试验检测环境污染物急性毒性备受重视，中国于1995年将这一方法列为环境毒性检测的标准方法（GB/T15441—1995）。相信这一技术会在中国的环保事业中发挥更大的作用。

生物传感器

利用发光细菌制作生物传感器，是人们研究的热点之一。发光细菌的发光强度与某些污染物的浓度呈较好的线性关系，能够稳定、灵敏、快速地反映环境中污染物的浓度变化，因此，利用发光细菌制备识别元件，成为国内外传感器研究和发展的热点。20世纪80年代初美国Beckman公司推出功能完备的生物毒性测试仪，它具有应用范围广，灵敏度高，相关性好，反应速度快等优点，发光细菌毒性测试（Luminescent bacteria toxicitytest，L．B．T．）技术在世界范围内迅速推广。细菌能够稳定、高效、持续发光是其被用做生物敏感材料来制备识别元件的基础，因此筛选优良的菌种是传感器制作的关键之一。海洋发光细菌是海洋环境中的正常微生物，从海洋环境中分离优良的发光细菌菌株是可行的。

基因组成

发光基因（lux gene）系统中包括结构基因luxC，D，A，B，E 和调节基因luxI和luxR 等。从不同发光细菌中分离得到的发光基因其种类和数量有所差异，例如luxF仅发现于明亮发光杆菌，但以上五个结构基因luxC，D，A，B，E 是普遍存在于已知的所有发光细菌中的。编码菌荧光素酶的基因是luxA 和luxB，在lux操纵子中，luxA 和luxB 是紧密相连的。以哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）为例，其luxA 基因中含有1065bp，编码的α亚基是355个氨基酸的多肽，分子量为40kD；luxB基因中含有972bp，编码的β亚基是有324个氨基酸的多肽，分子量为36kD。由α、β两亚基组成的荧光酶的分子量为76 kD。编码脂肪酸还原酶（多肽转移酶和还原酶）的luxC和luxD位于luxA、luxB基因的上游一侧，编码合成酶的luxE基因位于luxA，luxB基因的下游一侧。luxC 含有1431bp，编码的蛋白质含有477个氨基酸，分子量为55 kD；luxD 编码的蛋白质分子量为33 kD；luxE编码的蛋白质分子量为42 kD。在明亮发光杆菌中还发现有luxF基因，它通常位于luxB和luxE之间，其编码的蛋白质分子量为26 kD 左右，但lux F基因在弧菌属和异短杆菌属中的发光基因系统中尚未被发现。在以上所有菌株的操纵子中，这些基因的顺序都相同，均为lux CDAB(F)E。

在lux 系统中，结构基因上游有2个调节基因，它们是lux I和luxR。它们分别属于两个不同的操纵子之中，lux I在右面的操纵子中，右面的操纵子中还含有lux CDAB(F)E基因，lux I位于lux C 的上游。lux 系统的整个结构如下：luxR，lux DAB(F)E。lux I编码的是发光细菌自诱导物（autoinducer）因子合成酶，luxR 编码的是发光系统的调节蛋白。研究表明，luxI和luxR基因的表达产物都是lux 系统完整表达并产生发光的调节物质，任何一个基因的有效突变都会改变lux系统的表达水平，甚至使发光细菌变为暗变种。

发光基因特性

发光细菌所含的发光基因（lux gene）表达的直接结果是产生生物发光，非常直观而且易于检测，因而被广泛应用于基因操作，作为标记（marker）基因和报告（reporter）基因来研究基因的转导、表达和调控。另外，通过基因工程而产生的很多基因工程发光细菌的研究和应用也很有价值。完整的发光基因系统已经被成功地转入其他细胞中，如原核细胞、真核细胞和哺乳动物细胞。lux基因可以作为一个很好的标记基因重组在质粒载体或其他载体上。若将发光基因系统中的结构基因放在一个被试的启动子的下游，一并插入载体DNA中进行转导实验，可通过宿主细胞是否发光确定转导是否成功，并通过宿主细胞的发光强度的高低来确定发光基因的转录表达水平和结构基因上游的启动子的活性大小。另外，还可以用发光基因来研究终止子（terminator）的活性大小，以及研究其他细胞内的某些基因的表达与调控的规律。利用含有lux系统的具有感染力的载体（噬菌体）在感染宿主细胞时能产生生物发光的现象，可以研究其感染的过程和机理

具体应用

基因工程发光细菌是指通过基因工程技术将lux系统导入其他非发光宿主细胞后，形成一类能够发光的细菌。利用基因工程发光细菌可以快速测定化学物质及环境污染物的毒性，确定生物的存活能力，快速确定环境污染的程度以及进行环境质量的评价。还可以利用基因工程发光细菌进行细菌在土壤和水体中分布的研究等。

lux 基因作为报告基因，用其构建基因工程微生物，通过对光线的检测可以对微生物在环境中的生长、分布、活性等进行实时在线监测。如利用发光酶基因标记的荧光假单胞菌检测在小麦根圈的定植动态；跟踪棉花根圈中的绿针假单胞菌；用发光酶基因标记巨大芽孢杆菌，获得稳定发光的标记菌株，用于研究其在小麦根际的定殖动态和散布规律等。

某些细菌长期生活在含有某种化学物质的环境中，细菌基因组中含有对该物质具有特异性的诱导基因和降解基因，或具有对该物质的抗性基因。将这些基因与lux基因融合构成重组体，在特异的化学物质存在时产生诱导作用，启动诱导基因并导致lux基因表达，而由重组体的发光与否就可得知某化学物质是否存在。研究者们利用细菌对汞的抗性是依赖于Hg 与merR（汞抗性基因的调节基因）基因产物的结合和表达激活的原理，构建了由merR基因和luxAB基因融合的质粒载体，建立了发光强度与汞含量的关系。该系统灵敏度高而且专一性很强，用这种方法可检测出环境中纳克级的汞。因此，利用这种物质依赖性的基因工程发光细菌在这种特异性物质的存在条件下高水平的表达出生物发光，且发光强度与该物质的剂量呈正相关的特点，可以检测环境中该物质的存在量。已经构建了汞、砷、苯、萘等物质依赖性的基因工程发光菌，用于环境中此类物质的检测。发光细菌经过各种理化方法诱变处理后失去发光的能力，成为暗变异株。在接触致突变物后，暗变异株可恢复一定的发光能力（通常可使暗变异株的发光强度增加1000倍左右）。利用暗变异株恢复发光的现象，可对各种遗传毒物进行筛选、检测。此法与其他微生物学方法（如Ames试验）相比有灵敏、简便、快速、无需严格无菌操作等特点。已开发了“Mutatox”的检测系统，这是继发光细菌急性毒性检测的“microtox”之后推出的又一项发光细菌检测技术。

另外，将lux系统导人某种噬菌体的DNA中，利用噬菌体与其宿主菌之间严格的特异性，可以检测宿主菌的分布、数量以及活性，灵敏度高而且速度很快，为环境微生物检测提供了一种灵敏有效的方法。

方法介绍

水污染问题日益严重，与此同时也开发出许多灵敏、有效的环境监测方法，这些方法可以划分为两类：分析技术和生物监测。其中分析技术常常用于废水常规指标的测试，但不能反应水质综合毒性的大小。传统的生物监测以水蚤、藻类或鱼类为受试对象，虽然能反映毒物对生物的直接影响，但是这些方法的最大缺点是实验周期长，实验过程比较繁琐。针对传统生物毒性检测方法的不足，研究和开发新型生物毒性监测技术——发光细菌法。该方法以简便的操作方式、测量结果一目了然，受到了科研单位和企业的青睐。

自1672年R．Boyle观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制后，许多科学家相继对细菌的发光效应进行了大量的研究。本世纪70年代至80年代初，国外科学家首次从海鱼体表分离和筛选出对人体无害，对环境敏感的发光细菌，用于检测水体生物毒性，现已成为一种简单、快速的生物毒性检测手段。80年代初我国引进了这项技术，并先后分离出海水型和淡水型（青海弧菌）的发光细菌，用以检测环境污染物的急性生物毒性。

一般发光细菌长约1.5-3um（微米），宽度0.5-0.8um，因此肉眼根本看不到，要用显微镜放大至1千倍时方可以分辨它们的体形。而它们的发光，也要在特定的条件中才能看得见。青海弧菌是唯一的非致病型淡水发光菌，所以专利产品青海弧菌冻干粉在运输、使用过程中安全可靠，对废弃的菌液也不用进行特殊处理，不会引起二次污染。

间谍应用

新的发光细菌的产生实际上多少源自一些“有关阴谋”的想法。几年前，美国国防部高级研究计划局要求研究人员提交一些在无须电子设备的前提下编码机密信息的方法。当时，马萨诸塞州梅德福市塔夫斯大学的化学家David Walt正在与之前的指导教师、哈佛大学的化学家George Whitesides合作。他们曾一起想出了一个办法，向一根保险丝中添加多种金属盐，当被点亮时，保险丝会发出红外光的脉冲序列，从而编码一个信息。这让他们寻思用其他途径完成相同工作的可能性。于是两人决定尝试其他的方法――用细菌编码他们的秘密。

新的方案用7个大肠杆菌菌落取代了保险丝，而每个菌落又被赋予了一个不同的荧光蛋白质基因。只有当这些基因被开启从而使细菌合成蛋白质时才会发出荧光。而其颜色――包括黄色、绿色和红色――变化则取决于哪种基因得到了表达。所有这些差别都能够被肉眼清楚地识别。凭借手中的多彩细菌菌落，研究人员随后利用一对颜色不同的细菌创建了一个代码。而7种颜色使得他们拥有了49种组合，从而能够用来编码26个不同的英文字母以及23个字母数字符号，例如“@”和“$”。他们用若干对有色细菌写了几排信息。为了“印刷”这些信息，研究人员将细菌转移到一个琼脂板上，后者是一种细菌的生长介质，之后又压上了一张硝化纤维“纸”，其目的是为了固定这些细菌。

此时此刻，硝化纤维纸中的细菌依然是看不见的。但是通过将硝化纤维纸压入包含有化学触发剂――能够激活荧光蛋白的表达――的琼脂板，信息的接收者便可以开启关键的基因，并点亮各种颜色。（被选择用来点亮的蛋白质通常不会被细菌所使用，所以除非被研究人员激活，它们通常保持静默。）只要接收者知道哪种颜色相当于哪个字符，信息便被知晓了。但是Walt和他的同事还增加了一个额外的保障。他们在一些细菌中插入了对抗特定抗生素的基因；其想法是只有耐抗生素的细菌携带的才是真正的信息。如果这些信息落入到错误的手中，一旦基因被激活，接收者将会看到一片混乱的颜色而无法阅读。但是如果接收者加入了正确的抗生素，不具抗性的细菌及其颜色便会消失，从而使真正的信息变得清晰起来。第一个例子便是在9月26日出版的美国《国家科学院院刊》中写着的“this is a bioencoded message from the walt lab @ tufts university 2010”。

伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的化学家Kenneth Suslick表示：“这真是一个很酷的想法。”事实上，它与《螺旋》――由康奈尔大学物理学家Paul McEuen撰写的一部科幻惊悚小说――的构思是如此相似。在书中，Liam Connor―― 一位上了年纪的真菌生物学家――通过向不同真菌的DNA中插入荧光蛋白质基因，从而解开了一个几十年的神秘事件。虽然作为一个科幻小说迷，Walt表示想马上读到这本书，但他说之前并没有听说过它。如今借助他的发光细菌，他也可以书写一些关于自己的传奇了。