琼脂糖

有机化合物

琼脂糖是一种有机物，化学式C24H38O19，是一种白色或黄色珠状凝胶颗粒或粉末，为线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链。

基本信息

琼脂糖Agarose，缩写为AG，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖。琼胶糖化学结构是由1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链构成。

来源于红藻的多糖，其主要成分为多聚半乳糖，其中约70%为琼脂糖，30%为支链琼脂糖。琼脂糖具线型结构,由D-半乳糖和3,6-脱水半乳糖通过β-1，4和α-1，3连接交替形成重复双糖单位。支链琼脂糖则从β-1，3键分出另一链。用热水从海藻抽提的物质约含40%琼脂。市售的琼脂（俗称洋菜）常呈片状或疏松绳索状，通常作食用胶质，药物包装剂或细菌培养基使用。纯制的琼脂糖常在生物化学实验室中，作为电泳、层析等技术中的半固体支持物，用于生物大分子或小分子物质的分离和分析。

琼脂，它的英文名为agar。这个词来源于马来语的agar-agar，意思是胶状物。又名琼胶、菜燕、冻粉，是一类从石花菜及其它红藻类（Rhodophyceae）植物提取出来的藻胶（phycocottoid），在我国及日本已有三百多年（1658年）的历史。中国人亦称为洋菜或冻粉；台湾地区叫它菜燕，和燕窝的质感差不多。日本人称之为寒天（kanten），因为它在冬天收获。

琼脂作为一种独特的食品在我国已经有悠久的历史。它是从大型海洋藻类石花菜、紫菜、江篱等提取分离制成的，广泛应用于食品和生化等行业。我们常吃的果冻、冰淇淋、糕点、软糖、罐头、八宝粥中都含有琼脂。我国的山东、福建、广东、海南等拥有优越的海洋资源和气候条件，适宜大型海洋藻类的生长，是生产琼脂的主要地区，产品远销世界各地。

琼脂是由琼脂糖（agarose）和琼脂果胶（agaropectin）组成的。琼脂糖是线性的多聚物，琼脂果胶是由许多更小的分子组成的异质混合物。它们的结构相似，但带硫酸根和羧基组分，凝胶能力差。

计算化学数据

1.疏水参数计算参考值（XlogP）:无

2.氢键供体数量:0

3.氢键受体数量:1

4.可旋转化学键数量:6

5.互变异构体数量:7

6.拓扑分子极性表面积17.1

7.重原子数量:15

8.表面电荷:0

9.复杂度:178

10.同位素原子数量:0

11.确定原子立构中心数量:0

12.不确定原子立构中心数量:0

13.确定化学键立构中心数量:0

14.不确定化学键立构中心数量:0

15.共价键单元数量:1

凝胶性能

琼脂糖在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，这是它具有多种用途的主要特征和基础。琼脂糖凝胶性能通常用凝胶强度表示。强度越高，凝胶性能越好。质量较好的琼脂糖强度通常在1200克/cm2以上（1%胶浓度）。琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载体。在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基团，就会造成电内渗（EEO），电内渗对质点的移动产生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通常在0.2%以下，电内渗比较小，通常在0.13以下。这也就是琼脂糖比琼脂贵那么多的原因了。

1937年荒木第一次从琼脂中分离出琼脂糖，但直到1961年Hjertin首先发现了琼脂糖优异的使用性能后才引起了越来越多的关注，并开始工业生产。琼脂糖广泛应用于临床化验、生化分析和生物大分子物质的分离等领域。

用途

琼脂、琼脂糖因为有特殊的胶凝性质，尤其有显著的稳固性、滞度和滞后性，并且易吸收水分，有特殊的稳定效应；已经广泛使用于食用、医药、化工、纺织、国防等领域，据不完全统计，琼脂、琼脂糖的用途已有1000多种，被国际上称为“新奇的东亚产品”。在食品工业中可用于生产：水晶软糖、定型软糖、水产品、肉类罐头、果汁饮料、果肉饮料、米酒饮料、乳品饮料、精品、乳品蛋糕。

由于其良好的生物相容性又广泛用于生物分离介质的生产。

简单地说，把琼脂中的琼脂果胶去掉，剩下的部分，就是琼脂糖。

电泳技术

特点

天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。

（1）琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳。

（2）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98%~99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。

（3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定。

（4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。

常用琼脂糖作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于建立了超微量技术，0.1ug蛋白质就可检出。

琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。由于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之一。

DNA电泳

琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。

1．核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

（1）DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。

（2）琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

表琼脂糖浓度与DNA分离范围

琼脂糖浓度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0

线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1

2．核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环 DNA（covalently closed circular，cccDNA）＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm＞0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。

3．电泳方法

（1）凝胶类型

用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。

（2）缓冲液系统

缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。

常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。

TAE缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力，因此更常用。TBE浓溶液长期贮存会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×溶液，用时稀释10倍0.5×工作溶液即能提供足够缓冲能力。

（3）凝胶的制备

以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。

（4）样品配制与加样

DNA 样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油。

（5）电泳

琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。但是，在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。

电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。

（6）染色和拍照

常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。

转移电泳

生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作，1975年，Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜（NC膜）上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法。随后，Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为Northern印迹，1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电泳完成转移。1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上，称Eastern印迹。

国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，使印迹转移速度快效率高、重复性好，应用更加广泛。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤维素膜更方便。

进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，pH要远离pI，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的Tris-缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间有能有气泡。适当提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或电流不可过高。

凝胶电泳

一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。1983年Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间（外推为0的滞留时间）与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂直方向的不均匀电场，使DNA分子在凝胶中不断改变方向，从而使DNA按分子大小分开。后来Carle等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一水平式电泳槽和两组独立、彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组负极为W，正极为E。一块正方形琼脂糖凝胶板（10cm*10cm或20cm*20cm）呈45度放中央。电场在N-S和W-E之间交替建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的DNA分子大小有关。

电泳时，DNA分子处在连续间隔交替的电场中。首先向S极移动，然后改向E极。在每次电场方向改变时，DNA分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。只有当DNA分子达到一定构型后，才能继续前进。DNA分子净移动方向与加样线垂直，使样品中各组分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离数百万碱基对的大分子DNA。较新式的仪器电极间的角度和脉冲时间均可调，使用更加方便。

此外，琼脂糖平板常用于免疫扩散技术的电泳技术相结合的多种免疫电泳。

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