脉冲场凝胶电泳

简介

（PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种分离大分子DNA或者染色体的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子（＞10kb）移动速度接近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种方向（有一定夹角，而不是相反的两个方向）变动。DNA分子带有负电荷，会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。

制备加工

1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。

2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS 重悬细胞。

3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。

4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物细胞中大约含有基因组DNA 10μg）

5．用PBS配制2%浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。

6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。

7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。

8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。

9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。

10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。

11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/mlPMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。

12．室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次，将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L

EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。

13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。

标准物

λ多联体

1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。

2．用等体积TE配制的2%低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。

3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。

4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。

酵母染色体

1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml

YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。

2．4000×g转速，离心10min，然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。

3．仍以4000×g转速离心10min，再用SCE[1 mol/L 山梨醇，0.1mol/L枸椽酸钠，pH5.8及10 mmol/LEDTA (pH7.5)]溶液重悬。

4．取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。

5．溶液短暂离心后，再用SCE重悬细胞，使40μl SCE溶液中含5×107个细胞（相当于80μl体积的模块中含有5×107个细胞）。

6．溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀，37℃保温15～30min。

7．细胞悬液与等体积的SCE配制的2%低熔点琼脂糖凝胶混匀，保持在50℃。

8．将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。

9．凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37℃下振荡温育1～2小时。

10．将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml蛋白酶K，50℃温育48h。

11．用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗涤凝胶块3次，每次20min。

12．凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。

内切酶

1．应使用消毒溶液及戴无菌手套以免DNA降解。

2．在Falcon试管中用1×TE溶液漂洗凝胶块20min 3次，以去除EDTA。

3．混合：酶反应缓冲液（高、中或低盐缓冲液），100

mmol/L亚精胺（只用于高盐缓冲液状态），10～20单位的内切酶。20单位的内切酶就足以过夜完全消化10μg DNA。

4．设立一个除内切酶成分外含有混合物各组分的阴性对照，以检查是否有非特异性DNA降解。

5．将琼脂糖凝胶块加入反应混合溶液中：通常用消毒过的手术刀或套环将凝胶块移入。

6．若两种内切酶所需缓冲液条件一致，可以同时或先后用两种不同的酶进行消化（先用低盐缓冲液的酶消化，再调整盐浓度）。倘若首次消化的酶要求50℃条件，在第二个酶消化时要换缓冲液。

7．若要进行部分消化，则首先在同一温度和反应时间用1：10稀释的酶进行尝试。

凝胶电泳

1．将0.8%的琼脂糖在0.25×TBE中熔化后冷却至50～60℃，立即注入凝胶框架中，并插入梳子。

2．凝胶固化后小心地拔出齿梳，用2把无菌手术刀将DNA凝胶块上样。若用不同内切酶消化凝胶块，则取不同样品时应将手术刀片烧灼后冷却。将DNA大小标志物上样至凝胶的两旁。

3．用1%液态低熔点琼脂糖凝胶（0.25×TBE配制）密封狭槽。

4．若有气泡存在，用注射器驱赶气泡。

5．一旦密封的低熔点琼脂糖已固化（大约10min），可将凝胶搁入腔室，并用电泳缓冲液覆盖过胶面。

6．应设定合适的电压及转换时间（参考《分子医学技术》84页表8.1）并开始电泳。两个不同电泳方向的电流应相等。

7．电泳结束后，凝胶用0.25×TBE配制成的EB（0.4μg/ml）染色。

8．用泵自槽中排除缓冲液，续以双蒸水冲洗电泳槽。

9．凝胶成像：DNA在曝光的过程中可能会形成缺口。

10．用0.25mol/L HCl漂洗凝胶30min，让DNA脱嘌呤，并有利于转移。

11．凝胶用碱（变性溶液中）变性20min，两次，续以中性溶液1～5min。

12．采用标准Southern印迹方案将DNA转印至尼龙膜上。一般来说，印迹PFGE凝胶的时间较普通凝胶印迹时间长（约48h）。

PFGE'S Agarose

一、InCert琼脂糖----兆碱基片断DNA制备获准使用的琼脂糖。是一种极为有用的制备脉冲场凝胶电泳用染色体DNA样品的低胶凝温度琼脂糖。研究证实InCert琼脂糖凝胶可支持凝胶中染色体DNA的制备和限制性核酸内切酶消化。

⊙应用：脉冲场凝胶电泳。

⊙分析说明：胶凝温度（1.5%）:26℃－30℃

硫酸盐：≤0.15% 凝胶强度（1.0%）：≥400g/cm2

熔化温度（1.5%）：≤70℃

湿度：≤10%

EEO(-Mr)：≤0.10

二、SeaKem Gold琼脂糖是一种高凝胶强度，低EEO，标准胶凝温度的琼脂糖。这种遗传学术级别（Genetic Technology Grade，GTG）琼脂糖最适于脉冲场凝胶电泳法（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）快速分辨Mb（megabase）（50kb-10Mb）DNA和常规电泳方法分辨1-50kb的DNA与PCR产物。因其低EEO特性，SeaKem Gold琼脂糖中的DNA电泳迁移速度要显著的高于常规琼脂糖凝胶。PFGE的跑胶时间依使用的缓冲液和琼脂糖浓度的不同可减少至原电泳时间的50%。因其高凝胶强度，即使是使用低浓度（0.5%）的SeaKem Gold琼脂糖凝胶，操作处理依然很方便，从而允许在常规电泳中分离更大的DNA片断并减少PFGE中的DNA分离的耗时。

⊙应用：脉冲场凝胶电泳；标准凝胶电泳分离大于23kb的DNA片断；Mb大小DNA印迹。

⊙分析说明：

胶凝温度（1.5%）:34.5℃－37.5℃

硫酸盐：≤0.10%

凝胶强度(1.0%)：≥1800g/cm2

凝胶强度（1.5%）：≥3500g/cm2

湿度：≤10% EEO(-Mr)：≤0.05

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