ada

腺苷脱氨酶

腺苷脱氨酶（Adenosine deaminase）是一种参与嘌呤代谢作用的酶。它是用作拆解食物组织中的核酸中的腺苷。在人体中，它主要参与了免疫细胞的制造；若该酶突变，会造成T细胞、B细胞、自然杀伤细胞皆无法表现的严重复合型免疫缺乏症(SCID)

简介

腺苷脱氨酶（也称为腺苷氨基水解酶，或ADA）是参与嘌呤代谢的酶（EC3.5.4.4）。它需要从食物中分解腺苷和组织中核酸的转换。它在人体中的主要功能是免疫系统的发育和维持。然而，ADA的完整生理作用尚未完全了解。

结构

ADA以小形式（作为单体）和大形式（作为二聚体 - 复合物）存在。在单体形式中，酶是多肽链，折叠成8股平行的α/β桶，其围绕作为活性位点的中央深口袋。除8个中心β-桶和8个外周α-螺旋外，ADA还含有5个额外的螺旋：残基19-76倍折成三个螺旋，位于β1和α1折叠之间;两个反平行的羧基末端螺旋位于β-桶的氨基末端。

ADA活性位点含有锌离子，锌离子位于活性位点的最深凹陷处，由来自His15，His17，His214，Asp295和底物的五个原子配位。锌是活动所必需的唯一辅助因子。

底物腺苷被稳定并通过9个氢键与活性位点结合。与基质嘌呤环大致共面的Glu217的羧基在适当位置与基质的N1形成氢键。Asp296的羧基也与底物嘌呤环共面，与底物的N7形成氢键。Gly184的NH基团处于与底物的N3形成氢键的位置。Asp296与Zn形成键离子以及底物的6-OH。His238也与底物6-OH形成氢键。底物核糖的3'-OH与Asp19形成氢键，而5'-OH与His17形成氢键。在活性位点的开口处，通过基质的2'-OH和3'-OH，在水分子上形成另外两个氢键。

由于酶内活性位点的凹陷，基质一旦结合，几乎完全与溶剂隔离。当结合时，基材对溶剂的表面暴露是自由状态下基材的表面暴露的0.5%。

反应

ADA不可逆地使腺苷脱氨基，通过用氨基取代酮基将其转化为相关的核苷肌苷。

然后肌苷可被另一种称为嘌呤核苷磷酸化酶（PNP）的酶衍生化（从核糖中除去），将其转化为次黄嘌呤。

催化机理

所提出的ADA催化脱氨作用机理是通过四面体中间体进行立体特异性加成 - 消除。通过任何一种机制，作为强亲电试剂的Zn激活水分子，水分子被碱性Asp295去质子化以形成攻击性氢氧化物。His238定向水分子并稳定攻击氢氧化物的电荷。将Glu217质子化以将质子提供给底物的N1。

由于锌，Asp295和His238残基的位置，反应是立体特异性的，其全部面向底物的嘌呤环的B侧。

已经观察到对ADA的竞争性抑制，其中产物肌苷作用于竞争性抑制剂对酶活性起作用。

功能

ADA被认为是嘌呤代谢的关键酶之一。该酶已在细菌，植物，无脊椎动物，脊椎动物和哺乳动物中发现，具有高度的氨基酸序列保守性。高度的氨基酸序列保守性表明ADA在嘌呤补救途径中的关键性质。

首先，人类的ADA参与免疫系统的发育和维持。然而，还观察到ADA关联与上皮细胞分化，神经传递和妊娠维持有关。还提出，除腺苷分解外，ADA还刺激兴奋性氨基酸的释放，并且是A1腺苷受体和异源三聚体G蛋白偶联所必需的。腺苷脱氨酶缺乏会导致肺纤维化，表明长期暴露于高水平的腺苷可以加剧炎症反应而不是抑制它们。还已经认识到腺苷脱氨酶蛋白和活性在过表达HIF-1α的小鼠心脏中上调，这部分地解释了在缺血应激期间表达HIF-1α的心脏中腺苷的减弱水平。

病理学

腺苷脱氨酶基因中的一些突变导致它不被表达。由此产生的缺陷是严重联合免疫缺陷（SCID）的一个原因，特别是常染色体隐性遗传。ADA水平不足也与肺部炎症，胸腺细胞死亡和T细胞受体信号缺陷有关。

相反，导致该酶过度表达的突变是溶血性贫血的一个原因。

有证据表明不同的等位基因（ADA2）可能导致自闭症。

ADA水平升高也与艾滋病有关。

异构体

有两种ADA同种型：ADA1和ADA2。

ADA1存在于大多数体细胞中，特别是淋巴细胞和巨噬细胞中，它不仅存在于胞质溶胶和细胞核中，而且还存在于与二肽基肽酶-4（aka，CD26）连接的细胞膜上的外胚层中。ADA1主要参与细胞内活动，并且以小形式（单体）和大形式（二聚体）存在。小型到大型的相互转换受肺中“转换因子”的调节。

ADA2首次在人类脾脏中发现。随后在包括巨噬细胞在内的其他组织中发现它与ADA1共存。这两种同种型调节腺苷与脱氧腺苷的比例，增强了寄生虫的杀灭。ADA2主要存在于人血浆和血清中，并且仅作为同型二聚体存在。

临床意义

ADA2是人血浆中存在的主要形式，并且在许多疾病中增加，特别是与免疫系统相关的疾病：例如类风湿性关节炎，牛皮癣和结节病。在大多数癌症中血浆ADA2同种型也增加。ADA2不是普遍存在，而是仅在单核细胞 - 巨噬细胞中与ADA1共存。

可以使用高效液相色谱法或酶法或比色法测量总血浆ADA。也许最简单的系统是测量腺苷在分解为肌苷时释放的氨。在用腺苷的缓冲溶液温育血浆后，氨与Berthelot试剂反应形成蓝色，其与酶活性的量成比例。为了测量ADA2，在孵育之前加入赤 - 9-（2-羟基-3-壬基）腺嘌呤（EHNA）以抑制ADA1的酶活性。缺乏ADA1引起SCID。

ADA也可用于淋巴细胞性胸腔积液或腹膜腹水的检查，因为这种低ADA水平的样本基本上不考虑结核病。

结核性胸腔积液现在可以通过增加胸膜液腺苷脱氨酶水平，每升40 U以上来准确诊断。

克拉屈滨和Pentostatin是用于治疗毛细胞白血病的抗肿瘤剂;它们的作用机制是抑制腺苷脱氨酶。

1.肝脏疾病

ADA活性是反映肝损伤的敏感指标，可作为肝功能常规检查项目之一，与ALT或GGT等组成肝酶谱能较全面地反映肝脏病的酶学改变。血清中的ADA活性测定可用于：①判断急性肝损伤及残留病变，急性肝炎时，ADA轻、中度升高，但重症肝炎发生酶胆分离时，ADA明显升高。急性肝炎后期，ADA增高率高于ALT，其恢复正常时间也较后者为迟， ALT恢复正常而ADA持续升高者，常易复发或易迁延为慢性肝炎。②协助诊断慢性肝病，可作为慢性肝病的筛选指标。慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌患者血清ADA活性显著升高。其阳性率达85%～90%，慢性活动性肝炎ADA活性明显高于慢性迁延性肝炎，可用于二者的鉴别诊断。③有助于肝纤维的诊断④有助于黄疸的鉴别，阻塞性黄疸血清ADA活性及阳性率均明显低于肝细胞性黄疸及肝硬化伴黄疸者。

2.结核的诊断和鉴别诊断

鉴别结核性和非结核性胸、腹水及脑脊液是临床病因学诊断的一个常见难题。虽然近年来有结核抗体、PCR测定等新技术，但由于假阳性及价格等因素，普及应用仍受限制。据报道，即使多方检测，仍有20％左右的积液不能明确病因。因此应用ADA检测，对不明原因积液诊断又增添了一项诊断指标。结核菌感染人体虽然能产生抗体，但无保护作用，其抗感染免疫主要靠细胞免疫。细胞免疫作用是结核菌激活T淋巴细胞使其产生增殖，随之引起巨噬细胞的活化，活化的巨噬细胞内溶酶体酶大量增多，增强对细胞内结核菌的杀伤作用。早在1978年Piras报道ADA在结核性胸水时P/S>I.0，癌性胸水<1.0(P/S表示液/血比值)，其机理为：由于各种物质的生成、存储、代谢以及化学特性、生物学活性、相对分子质量等各不相同，加之细胞血管、浆膜的屏障作用在各种因素下的通透性改变，造成了检测物质在胸水中与血清中浓度上的差异与规律性比例，为诊断提供有价值依据。在胸腹水检测中，结核性胸腹水ADA活性显著增高，癌性胸腹水不增高，而血清ADA活性无显著差异。

3.糖尿病的鉴别诊断

据国内外文献报道，2型糖尿病患者血清ADA 明显升高，且与HbA1c 有明显正相关关系，1型糖尿病患者的ADA 与H bA1c无明显相关关系。因此，测定血清ADA对于鉴别诊断1型与2型糖尿病、衡量2型糖尿病患者血糖控制好坏有一定的意义。

4.血液病的诊断

血清ADA活性检测有助于白血病的临床分期和分型判断，白血病的鉴别诊断和慢粒或慢淋急变的早期诊断，并可作为判断患者体内白血病细胞负荷情况的一项生化指标。另外，恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性组织细胞病和骨髓增生异常综合征等恶性血液病患者血清中的ADA活性也均升高。

5.系统性红斑狼疮(SLE)的病情评价

SLE患者血清ADA 活性明显增高, 且其增高程度与病情的严重程度密切相关。因此，监测SLE 患者血清ADA 活性对评价病情及治疗效果有重要的临床意义。

6.其他疾病的辅助诊断 ADA还可用于缺铁性贫血，肾综合征出血热，鼻息肉等疾病的病情观察及疗效评价。总之，ADA活性检测已成为多种疾病的辅助诊断指标之一，为许多疾病的早期诊断、鉴别诊断、病情监测及治疗效果评价提供重要的参考价值。这也是我们检验科开展此项目的目的所在。

检测方法演变

近十几年来，随着对ADA的深入研究，检测方法也不断发展。目前已发展了四代。

第一代ADA测试

ADA将腺苷（Adenosine）脱氨产生次黄苷（Inosine）和氨（NH3）。一个ADA活性单位在测试特定条件下每分钟脱氨1μmole腺苷成为次黄苷。通过动态测量腺苷265nm处吸光度下降的速度，可以测算ADA的活性大小。Kaplan法（1955）由此建立。由于高底物浓度造成吸光度过高，该法仅适用于腺苷浓度低于40μM。如此低的底物浓度达不到底物饱和要求，造成ADA活性检测失真。因此，该法不适用于临床应用。

第二代ADA测试

原理为腺苷脱氨酶催化腺嘌呤核苷水解，产生次黄嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot显色反应（1859）测定反应过程中产生氨的量，从而计算血清ADA活性单位。所需试剂易配制，仪器简单，但灵敏度低，易受外源性NH3影响，空白过高，不能直接测定红细胞ADA活性。

同样原因，ADA偶联谷氨酸脱氢酶（Glutamate Dehydrogenase， GLDH）反应：

通过测量340nm处NADPH吸光度下降的速度来测算ADA活性。该法也因血清含氨干扰，以及测试系统中过高NADPH造成非特异性氧化而无成算。

第三代ADA测试

Kalckar氏应用ADA偶联嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase，PNP）和黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase， XOD）反应连续监测法。通过测量293nm处尿酸盐吸光度上升的速度来测算ADA活性。

但是，293nm时血清吸光度太高，造成临床应用不便。

第四代ADA测试

通过ADA偶联PNP，XOD，过氧化氢酶（Catalase）和醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase），借助过氧化氢（H2O2）反应测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算ADA活性。该法克服了以往ADA测试的困难，然而，鉴于试剂成本高，阻碍实际临床使用。

最新对第四代测试方法的改进为偶联PNP，XOD和过氧化物酶（Peroxidase， POD）反应。ADA酶解腺苷（Adenosine）脱氨产生次黄苷（Inosine）；再通过PNP的作用，生成次黄嘌呤（Hypoxanthine）；后者在XOD氧化下生成尿酸（Uric Acid）和过氧化氢（H2O2）；最后在POD的作用下H2O2再与N-Ethyl-N-（2-hydroxy-3-sulfopropyl）-3-methylaniline （EHSPT）、4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine， 4-AA）反应（Trinder氏反应），生成紫红色的有色醌（Quinone dye）。通过动态测量有色醌550nm处吸光度上升的速度来测算ADA的活性。从反应原理可知NH4+对该法无影响。其原理反应方程式如下：

反应具有测定精密度高，抗干扰能力强，适合自动化快速测定的特点，为临床常规开展ADA检测应用创造了有利条件。

迈克腺苷脱氨酶（ADA）检测试剂盒性能指标

检测方法：XOD-PAP法（第四代改良法），不与其它核苷反应，无NH4+影响，灵敏度高。

剂型：液体双试剂，直接使用，避免复溶引起瓶间差。

线性范围：0～200U/L，γ2≥0.99

准确度：不准确度正常水平≤15%，异常水平≤10%。

稳定性：密闭避光贮存2～8℃可稳定12个月，开瓶上机2～8℃避光稳定30天。

抗干扰能力：标本中胆红素≤342umol/L，血红蛋白≤200mg/dl，甘油三酯≤8.47mmol/L，抗坏血酸≤4mg/dl 及NH4+对本试剂测定无影响。

适用性：适用于各种半/全自动生化分析仪。

参考范围：4～22U/L（37℃），建议各实验室建立自己的参考值范围。

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