自噬

Ashford 和 Porter提出的现象

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，借此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

名词释义

自噬（autophagy）是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体（autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

自噬的功能

(1)饥饿应答时的作用,在不同的器官如肝脏或在培养细胞中,氨基酸的匮乏会诱导细胞产生自体吞噬,由自体吞噬分解大分子,产生在分解代谢和合成代谢过程中所必须的中间代谢物。

(2)在细胞正常活动中的作用,如在动物的变态发育、老化和分化过程中,自体吞噬负责降解正常的蛋白以重新组建细胞。尽管通常人们认为自体吞噬不具有选择性,但是在某些病理和压力条件下,通过自体吞噬能选择性地隔离某些细胞器,如线粒体、过氧化物酶体等。

(3)在某些组织中的特定功能,如黑质的塞梅林神经节中,多巴胺能神经元中的神经黑色素的合成就需要把细胞质中的多巴胺醌用AV包被隔离起来。

自噬发生过程

在此过程中，自噬体的形成是关键，其直径一般为 300 ~ 900 nm，平均 500 nm，囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有 8 min 左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。

由于自体吞噬较少受到关注,而且很难在体外实验条件下实现,因此,对自体吞噬的机制还不是很了解。研究主要集中在酵母及其它重要的单细胞真核生物,而对植物和哺乳动物细胞中的自体吞噬过程的了解则更少。尽管对自体吞噬具体过程的了解还需要大大加强,但是人们已经勾勒出自体吞噬过程的大致轮廓:细胞质中的线粒体等细胞器首先被称为“隔离膜”的囊泡所包被,这种“隔离膜”主要来自于内质网和高尔基体;囊泡最终形成双层膜结构,即自吞噬体(autophagosome),也称之为初始自体吞噬泡(initial autophagic vacuoles , AVi);自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡(intermediate autophagic vacuoles, AVi/d);最终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡(degrading autophagic vacuoles, AVd),由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。在整个自体吞噬过程中,细胞质和细胞器都受到破坏,最明显的是线粒体和内质网受损。虽然自体吞噬并不直接破坏细胞膜和细胞核,但是有证据表明,在最初断裂或消化后,细胞膜和细胞核会最终变成溶酶体以消化和分解自身。

自噬分类

根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同，自噬分为以下几种。

①大自噬：由内质网、高尔基体或细胞质膜等来源的膜包绕待降解物形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物；

②小自噬：溶酶体的膜直接包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解；

③分子伴侣介导的自噬（chaperone mediated autophagy, CMA）：胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。

自噬发生条件

自噬体（autophagy）

自噬溶酶体（autolysosome）

当自噬体与溶酶体融合后，形成自噬溶酶体。

自噬性溶酶体是一种自体吞噬泡, 作用底物是内源性的,即细胞内的蜕变、破损的某些细胞器或局部细胞质。这种溶酶体广泛存在于正常的细胞内，在细胞内起“清道夫”作用，作为细胞内细胞器和其它结构自然减员和更新的正常途径。在组织细胞受到各种理化因素伤害时，自噬性溶酶体大量增加，因此对细胞的损伤起一种保护作用。

自噬性溶酶体的作用底物是内源性的，即来自细胞内的衰老和崩解的细胞器或局部细胞质等。它们由单层膜包围，内部常含有尚未分解的内质网、线粒体和高尔基复合体或脂类、糖原等。正常细胞中的自噬性溶酶体在消化、分解、自然更替一些细胞内的结构上起着重要作用。当细胞受到药物作用、射线照射和机械损伤时，其数量明显地增多。在病变的细胞中也常可见到自噬性溶酶体。

溶酶体的作用还包括对细胞内物质的消化，溶酶体能消化分解经胞吞作用摄入细胞内的各种物质和细胞内衰亡或损伤的各种细胞器等。

吞噬性溶酶体内的各种大分子在水解酶的作用下，可被分解为简单物质。例如，能将蛋白质分解为二肽或游离氨基酸；把核酸分解为核苷和磷酸；使碳水化合物分解为寡糖类或单糖；将中性脂肪分解为甘油和脂肪酸等。这些被分解而生成的可溶性小分子物质，能透过溶酶体体膜进入细胞质基质，重新参与细胞的物质代谢，一些未被完全消化的物质残留下来，形成残余小体。

在骨生长和骨重建过程中，溶酶体对骨质的更新起着重要作用。破骨细胞的溶酶体酶能释放到细胞外，分解和消除陈旧的骨基质，这是骨质更新的一个重要步骤。溶酶体酶释放的具体过程可能是：细胞内的环化酶活性发生改变后，随着cAMP的增加，蛋白质激酶被活化而引起微管及其周围的蛋白质的磷酸化，其结果微管发生聚集，致使溶酶体向细胞膜方向移动，并与细胞膜相互融合，然后溶酶体内的水解酶被排出细胞外，以分解和消除陈旧的骨质。

自噬的研究方法

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：

（一）自噬诱导剂

1）Brefeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

5）Rapamycin：mTOR抑制剂 (最常用)

6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

（二）自噬抑制剂

1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂

2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）

除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

（三）自噬检测方法：

细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

1）Western Blot检测LC3的切割

利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3单荧光体系/mRFP-GFP-LC3双荧光体系等融合蛋白来示踪自噬形成：

GFP-LC3 单荧光自噬指示体系：

利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。

另一种方法是利用mRFP-GFP-LC3 。

mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：

由于分子生物学的发展，已经诞生了mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。

mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。

3）透射电镜下观察自噬体的形成：

自噬经历了：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)

透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。

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