基因枪法

粒子轰击细胞法

基因枪法，又叫粒子轰击细胞法或微弹技术。基因枪的作用是用压缩气体(氦或氮等) 动力产生一种冷的气体冲击波进入轰击室(因此可免遭由“热”气体冲击波引起的细胞损伤)，把粘有DNA 的细微金粉打向细胞，穿过细胞壁、细胞膜、细胞质等层层构造到达细胞核，完成基因转移。只有很少部分的细胞符合这样的要求，大多数会因为力道不对而失败，但这少部分细胞已足够完成基因转移操作的需要。利用氦气、金粉的原因主要是: 密度大，穿孔容易; 口活性小，不易毒害细胞。

定义

在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面，轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒 RNA能进行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因导入洋葱表皮细胞。该技术已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功。

基因枪分类

这一方法是依靠一种基因枪来帮助导入外源基因。基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。它具有应用面广，方法简单，转化时间短，转化频率高，实验费用较低等优点。对于农杆菌不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的局限。基因枪的转化频率与受体种类、微弹大小、轰击压力、制止盘与金颗粒的距离、受体预处理、受体轰击后培养有直接关系。

枪法操作

基因枪法：将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低。另外这种方法也用于基因治疗和抗体制备，并已取得初步成效。

方法效果安全

基因枪法( Gene gun) 又称粒子轰击、高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术，是由美国Comel 大学生物化学系John. C. Santord 等于1983 年研究成功。首先在植物中获得成功应用。通过动力系统将带有基因的金属颗粒( 金粒或钨粒) ，将DNA 吸附在表面，以一定的速度射进靶细胞，实现稳定转化的目的。小颗粒穿透力强，不需对靶细胞进行修饰。基因枪具有应用面广、方法简单、对治疗基因的大小要求不严格、转化时间短、瞬时表达持续时间长、一次处理多个细胞、安全性高等优点。用比普通的注射法低2 ～ 3 个数量级的DNA 即可产生较高的保护作用，但转化效率相对较低，是广泛应用且十分高效的免疫方法。

2003 年，有学者提出基因枪免疫无论是其介导产生的抗体效价还是其所需的DNA 疫苗剂量，均优于肌注途径。Kim HJ 等人为了证明这一说法，将P. vivax 的AMA － 1 基因克隆并在质粒载体UBpcAMA － 1 中表达，可获得一个大约56. 8kDa 的蛋白。通过肌内免疫或者通过基因枪4 次免疫BALB/c 小鼠，在最后1 次注射的2 周后通过流式细胞仪检测脾T 细胞亚型的比例。实验结果显示，肌内注射的鼠脾细胞在CD8 + T 细胞和CD4 + T 细胞的比例中无意义; 然而，在运用基因枪免疫的鼠体内，观察到了显著增加( P ＜0. 05) 的CD8+ 细胞。结果表明，当其肌内注射编码P. vivax AMA － 1 的质粒DNA 疫苗时，产生的细胞免疫原性很低; 然而，通过基因枪注射技术时可观察到明显效果。

通过基因枪转运金粒包裹的DNA 疫苗可抑制肿瘤组织的生长。Abe A 等通过皮内基因枪转运DNA ( pNGVL －hFLex) 包裹的金粒到靶肿瘤周围的鼠皮肤，检测通过基因枪介导的一种Flt3 配体FL ( 一种新发现的细胞因子，可促进树突状细胞的生长) 转移在鼠模型中对肿瘤生长上的抑制效果。实验结果: 通过免疫组化学和荧光激活的细胞分类( FACS)显示了基因枪介导的DNA ( pNGVL － hFLex) 的转移显著增加了CD11c ( + ) DCs 在肿瘤组织中的数量，抑制了MCA205 肿瘤的生长。从而得出，通过基因枪成功的进行了FL 治疗，在肿瘤组织中显著增加了DCs 细胞的数目并抑制了肿瘤的生长。

由于金粒成本过高，Chen Cad 等人比较了裸DNA 疫苗和金粒包裹的DNA 疫苗分别通过低压基因枪和高压基因枪转运时在体内产生的免疫效果。实验检测了低压的基因枪转运的非载体裸DNA 疫苗，同金珠包裹的DNA 疫苗相比能否产生相似的抗原特异的免疫应答和抗肿瘤效果。结果显示: 在鼠体内，裸CRT/E7 DNA 疫苗导致更强烈的免疫反应，大幅度的E7 特异性CD8 + T 细胞前体和E7 特异性抗体有所增加; 裸CRT/E7 DNA 疫苗产生强大的抗皮下的E7 表达肿瘤和抗E7 表达前的转移性肺癌的抗肿瘤效果; 此外，裸CRT/E7 DNA 疫苗免疫的鼠同用金珠包裹的CRT/E7 DNA 疫苗免疫的鼠相比在皮肤表面的烧伤影响明显减少。实验最后得出: 裸CRT/E7DNA 疫苗通过低压基因枪转运，同传统的金珠包裹的DNA 疫苗相比，能产生相似强大的免疫应答和有效的抗肿瘤效果，且更方便，并具有更小的副作用。

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