慢病毒载体

病毒载体

慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

概念

慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

辅助成分

慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。

慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

基本原理

慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。

包装成分

由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。

载体成分

与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。

改进

包膜蛋白

采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，分别取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，使HIV-1载体颗粒包上了VSV或双嗜性MLV的包膜。这样做的结果至少具有三个方面的积极意义：①包膜的更换进一步降低了慢病毒载体恢复成野生型病毒的可能；②使HIV载体感染宿主的范围不再仅限于CD4+细胞，而扩大到几乎能感染所有组织来源的细胞；③VSV的包膜赋予慢病毒载体颗粒高度的稳定性，使其能够通过超速离心而浓缩，达到高滴度。Naldini等已使慢病毒载体滴度由105转录单位(TU)/ml达到108TU/ml。

包装成分

包装成分的构建应在不重组病毒的装配和感染力的前提下，尽可能地减少无关的HIV-1蛋白的表达，为野生型病毒的恢复设置障碍。Naldini等在构建包装质粒时，阻止env基因的表达。在此基础上，Zufferey等将包装包装质粒上表达调节蛋白Nef、Vif、Vpr和Vpu的4个基因分别删除或联合删除。这4个调节蛋白或已被证实、或被高度怀疑是构成HIV毒性的因素，将其删除、加上包膜蛋白的替换，可使制备HIV载体过程中产生野生型病毒的可能必微乎其微。

载体质粒

载体质粒上HIV-1的顺式序列通常包括两端的LTR、剪切位点及包装信号Ψ等。此外，研究表明，gag基因5′端的序列可提高载体RNA的包装效率；Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆。因此，Naldini等在载体上保留了gag基因5′端350bp的序列及位于env序列中的RRE，提高了产生载体颗粒的能力。

应用前景

获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的基因治疗

对于AIDS的基因治疗方案，基本上是以逆转录病毒载体介导的方式，将抗病毒基因体外导入CD4+T淋巴细胞或CD34+的造血祖细胞，再回输体内。常用的抗病毒基因包括自杀基因、反义RNA、核酶、RNA诱饵的相应DNA序列以及调节蛋白或结构蛋白的突变体基因等。由于这些治疗基因不能到达巨噬细胞和多能干细胞，因此难以重建免疫；此外，体外操作费用昂贵，不适于大规模应用。　慢病毒载体的为AIDS的基因治疗带来了新的希望，它可能具有以下优势：第一，利用HIV-1本身包膜蛋白Env包裹的载体颗粒可以将抗病毒基因直接运抵CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，适于直接的体内治疗，而包被了VSV包膜的载体颗粒又能感染多能干细胞，有利于免疫重建；第二，患者体内的野生型HIV-1可将携带抗病毒基因的载体拯救出来，使载体扩增并扩散到周围更多的细胞中发挥抗病毒作用；第三，如果将抗病毒基因置于HIV-1本身的长末端重复序列(LTR)控制之下转导细胞，则只有当HIV-1感染该细胞时，Tat蛋白反式激活LTR中的TAR元件，抗病毒基因才会表达，使基因表达具有了靶向性。

神经系统疾病的基因治疗

Lesch-Nyhan综合征是一种遗传性的代谢性脑病，由编码次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT)的基因缺陷所引起；帕金森氏病是一种退行性脑病，由于产生多巴的神经元退化，导致大脑纹状体内多巴胺水平降低，临床上给患者注射左旋多巴可改善症状，但长期注射及药物的副作用令患者难以承受。较为理想的方式是在脑内持续表达酪氨酸羟化酶(TH)，使其催化酪氨酸转变为为左旋多巴；Alzheimer氏病也是一种多因素引起的退行性脑病，造成大脑皮质和海马回神经元萎缩，通常采用神经营养因子防止神经元退化。由于慢病毒载体能够体内转导神经元并建立长期稳定的表达，因此对于以上疾病的基因治疗非常具有吸引力。可以设想，分别将编码HPRT、TH或神经营养因子的基因通过慢病毒载体介导，体内注射至神经元，有可能对上述疾病产生良好效果。

血液系统疾病的基因治疗

造血干细胞一直被认为是对血液系统恶性肿瘤或其它疾病(如地中海贫血、镰刀性红细胞贫血、血友病等)进行基因治疗的理想靶细胞，但由于缺乏使目的基因在造血干细胞稳定表达的，这方面的研究进展不明显。尽管小鼠逆转录病毒载体能够转导经细胞因子刺激后进入细胞周期的造血干细胞，但经此处理的干细胞性质可能会发生改变。慢病毒载体则可通过直接转导静止的干细胞避免这类。将多药耐药(MDR)基因导入造血干细胞，可使其耐受大剂量化疗，可能成为治疗白血病和其它恶性肿瘤的有效途径；将正常珠蛋白基因或凝血因子Ⅷ、Ⅸ分别导入造血干细胞，有望对地中海贫血、镰刀性红细胞贫血和血友病产生疗效。

存在问题

尽管慢载体的研究有了很大进展，但距离临床应用还有很长的路要走。首先，重组病毒的滴度还不够高，除Naldini等报道的结果外，其余均在101TU/ml～103TU/ml之间，难以达到体内应用的需要；其次，由于HIV复杂的生物学性质，要像常用的小鼠逆转录病毒载体那样建立稳定的HIV载体包装细胞十分困难，已建立的包装细胞均不理想。据报道，Vpr是一种使细胞进入静止期的强诱导剂，也是建立包装细胞的主要障碍之一。如果确如前文所述，包装质粒中的vpr基因并非必需、去除后不影响载体的转导能力，则建立稳定的包装细胞是大有希望的。

在保证HIV-1载体的安全性上，迄今已做了种种努力，要产生有复制力的HIV，必须在不同的质粒上发生多次非同源重组事件。即使如此，一旦用于人体试验，仍然不能打消人们对感染有复制力的HIV-1的顾虑。更为谨慎的做法是，以非人类的慢病毒为基础构建载体，如猴免疫缺损病毒(SIV)、猫和牛免疫缺损病毒(FIV和BIV)、马传染性贫血病病毒等，而这些工作尚属空白。

参考资料

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